作者：

Boren ???Lin,PhD,Shadie ????Nimri?Sean ???Arabian?Kinnari ????Watson,PhDI 1Opentrons ??Labworks,Inc.,?Biotage???LLC.

摘要
本次應(yīng)用針對(duì)使用 BiotagePhyTip° 柱在 Opentrons OT-2 自動(dòng) 化移液工作站上進(jìn)行雙流層析的自動(dòng)化進(jìn)行了應(yīng)用開(kāi)發(fā)蓬勃發展。測(cè)試了兩 種類(lèi)型的 PhyTip 柱：用于 His 標(biāo)記蛋白提取的 Ni-IMAC 柱和用于 人源 IgG 純化的蛋白 A 系列柱意向，包括蛋白 A、ProPlus 和ProPlus LX資源優勢。結(jié)果表明，OT-2 和 PhyTip 柱結(jié)合使用96孔板進(jìn)行小規(guī)模蛋白樣品處理全過程，可獲得優(yōu)異的樣品產(chǎn)量深刻認識、濃度。

關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)
在使用PhyTip Ni-IMAC柱進(jìn)行純化時(shí)品質， OT-2 能夠在保持活性 的同時(shí)對(duì)His標(biāo)記的GAPDH 蛋白進(jìn)行純化利用好。同時(shí)，在使用蛋白 A解決問題、ProPlus 和 ProPlus LX PhyTip 柱進(jìn)行人源 IgG 純化時(shí)系列，OT-2 也展現(xiàn)了出色的純化能力。使用蛋白A相互配合、ProPlus 和ProPlus LX PhyTip 柱慢體驗，可以在OT-2上全自動(dòng)運(yùn)行多步驟純化，例如免疫沉淀相對簡便。
● 蛋白質(zhì)分析驗(yàn)證了提取蛋白為目標(biāo)蛋白重要組成部分，成品是符合預(yù)期的。
● 在實(shí)驗(yàn)設(shè)置中合作，該應(yīng)用協(xié)議可以處理最多96個(gè)樣品勃勃生機，且僅需占用很少的人工操作時(shí)間。

簡(jiǎn)介
近年來(lái)極致用戶體驗，由于蛋白質(zhì)表征分析和功能測(cè)定的發(fā)展迅速和諧共生，行業(yè)對(duì)蛋白 質(zhì)分析的需求與日俱增。因此適應性強，許多可用于通過(guò)親和層析擴(kuò)大蛋白 質(zhì)分離通量的技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生技術交流，而親和層析已成為早期藥物發(fā)現(xiàn)中的重要工具。然而拓展，市面上適用于小規(guī)模蛋白純化的設(shè)備卻很少創造更多。并且由于研究人員缺乏編程和自動(dòng)化專(zhuān)業(yè)知識(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致在建立 這些流程時(shí)產(chǎn)生很多不必要的開(kāi)銷(xiāo)不斷進步，在優(yōu)化工作流程時(shí)工藝技術，會(huì)帶來(lái)額外的成本負(fù)擔(dān)。

PhyTip 柱是基于移液器吸頭進(jìn)行工作的色譜柱規模，通過(guò)移動(dòng)相(例 如樣品溶液)在固定相(即填充在尖端中的樹(shù)脂)上的雙向流動(dòng)來(lái) 將目標(biāo)生物分子與非目標(biāo)分子分離近年來，這個(gè)過(guò)程被稱(chēng)為雙流層析講道理。純 化后的樣品可以以小體積洗脫，從而得到高濃度的樣品技術先進。雙流層析 是一種溫和的純化過(guò)程更多的合作機會，產(chǎn)生具有高生物活性的蛋白質(zhì)。這些 PhyTip 柱利用了蛋白 A 進(jìn)行抗體的純化或富集認為。蛋白 A 是一種分 子量為49 kDa 的蛋白服務好，對(duì)大多數(shù) IgG 的 Fc 區(qū)域具有較高的親和力。

ProPlus (MabSelectTM SuReTm,Cytiva)和ProPlus LX (MabSelect SuRe,Cytiva) 是使用經(jīng)過(guò)改良的蛋白 A 制備吸頭反應能力。蛋白 A 具有更強(qiáng)的結(jié)合目標(biāo) IgG 的能力發展邏輯，通常被用于抗體的純化和富集。

金屬親和層析(IMAC) 是另一種常見(jiàn)的方法有所提升，用于從粗樣品中純 化或富集目標(biāo)蛋白聽得進。這種方法利用金屬離子提取具有基因工程標(biāo)簽 的重組蛋白，它們通常是能夠螯合金屬離子的肽序列先進水平。PhyTip柱與 鎳離子(Ni)-IMAC 親和樹(shù)脂結(jié)合便利性，通過(guò) Ni2+ 和組氨酸堿基之間的強(qiáng)親和力，高效純化多組氨酸 (His) 標(biāo)記的蛋白重要平臺。

OT-2 是一個(gè)對(duì)生物學(xué)家非常友好的自動(dòng)化平臺(tái)深刻認識。PhyTip 柱使用與 OT-2 的單通道和8通道移液器兼容的吸頭，從而實(shí)現(xiàn)了在 OT-2 上 執(zhí)行全自動(dòng)蛋白純化應用提升。本次研究對(duì) PhyTip 柱在 OT-2 上的性能表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)估主動性，并展示了該平臺(tái)可適配多種應(yīng)用的能力。通過(guò)PhyTip 柱與 OT-2 平臺(tái)結(jié)合使用前沿技術，研究人員能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化運(yùn) 行蛋白質(zhì)純化基礎，提高操作的便捷性和一致性。這為各種不同的應(yīng)用提供了更適用的解決方案多種方式，并為高通量的純化和富集提供了支持對外開放。

材料和方法
在 Opentrons OT-2 平臺(tái)上使用PhyTip 色譜柱進(jìn)行蛋白質(zhì)純化工作流程概述
該過(guò)程的第一部分是“試劑孔板準(zhǔn)備”,用于準(zhǔn)備 PhyTip 柱架和試 劑孔板。其中包括平衡緩沖液孔板深入交流研討、兩個(gè)用于不同洗滌緩沖液的孔 板以及一個(gè)洗脫緩沖液孔板資料。該過(guò)程的第二部分是“蛋白質(zhì)純 化”,通過(guò)使用 PhyTip 柱進(jìn)行雙流層析來(lái)捕獲和富集目標(biāo)蛋白 質(zhì)。這是通過(guò)使樣品或緩沖液通過(guò)柱體內(nèi)部的樹(shù)脂(即上下移液) 而實(shí)現(xiàn)的關註度。設(shè)置環(huán)節(jié)包括循環(huán)次數(shù)橫向協同、流速和緩沖液體積，這些設(shè)置根據(jù)具體應(yīng)用進(jìn)行調(diào)整(表1)敢於挑戰。

表1:?PhyTip?柱在?Opentrons?OT-2?上測(cè)試的設(shè)置和運(yùn)行時(shí)間

試劑孔板制備和蛋白質(zhì)純化方案的 OT-2 平臺(tái)布局示意圖(圖1)
在這項(xiàng)研究中測(cè)試的 PhyTip 柱型號(hào)包括：
● Pro A 20μL PTX-93-20-01
● ProPlus 20 μL PTX-93-20-07
● ProPlus LX 20 μL PTX-93-20-26
● Ni-IMAC 20 μL PTX-93-20-03

蛋白質(zhì)純化流程
1.取出 PhyTip 柱
2.平衡化
3.捕獲目標(biāo)蛋白質(zhì)
4.洗滌(第一次)
5.洗滌(第二次)
6.洗脫

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
分離 His 標(biāo)記的 GAPDH, 同時(shí)保留活性通過(guò) SDS-PAGE 和蛋白定量分析不斷創新，我們得出了在 PBS 中提取的 帶有 His 標(biāo)簽的 GAPDH 樣品具有理想產(chǎn)量和一致性的結(jié)論(平均產(chǎn)量為79%,變異系數(shù)為3%) (圖2上部)。

從細(xì)菌裂解液中分離 His 標(biāo)記的 GAPDH生產(chǎn)重組蛋白的常見(jiàn)方法是用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌
OT-2 平臺(tái)上使用 PhyTip 柱沒(méi)有破壞酶活性，這是通過(guò) GAPDH活性測(cè)定得出的結(jié)果(圖2中部)堅持先行。此外，結(jié)果還表明滿意度，在兩種不同蛋白質(zhì)的樣品中均能夠成功地將 His 標(biāo)記的 GAPDH 與非目標(biāo)蛋白的BSA 分離開(kāi)來(lái)(圖2下部)情況較常見。

原文地址：在OT-2上使用Biotage雙流色譜PhyTip柱進(jìn)行自動(dòng)化蛋白質(zhì)純化