作者
Boren Lin,PhD,Kinnari Watson,PhD

應用概述
酶免疫分析 (EIA) 或酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA) 是液體樣本中檢測目標分子(例如抗原)的常用分析工具適應性，通常用于免疫診斷 或研究創造性。該測定一般采用96 孔板格式，并且工作流程通常包括 試劑轉(zhuǎn)移和混合，以及一些在恒定溫度下的孵育和洗滌步驟引人註目。這 些步驟均要求樣本處理高度一致性。為了實現(xiàn)自動化先進的解決方案，我們使用 OT-2 自動化移液工作站搭配熱振蕩儀研發(fā)并測試了 ELISA 全自 動化的方案方法，該方案使用 Takara Bio 公司的夾心法 EIA 試劑盒 檢測人類纖連蛋白(FN),Tecan 的競爭法 ELISA 試劑盒檢測 唾液中的皮質(zhì)醇聽得懂，以及 Cell Sciences 的另一種競爭法 ELISA 試劑盒用于定量血清樣本中的中和SARS-CoV-2 抗體應用優勢。

關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)
配備8通道移液器和熱振蕩儀的 OT-2 移液工作站具備高精度自動化完成 ELISA的能力。
在更高的吞吐量設(shè)置中全方位，該協(xié)議可以用最少的操作時間處理多達96個樣本高效節能。

應用介紹
酶免疫分析 (EIAs) 或酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISAs) 是一種通過 高度特異的抗體-抗原的相互作用對液體樣本的目標分子(例如 抗原)進行檢測和定量的技術(shù)。這種測定通常在96孔或384孔 板上進行深刻認識，我們把抗原固定在孔板上核心技術，可以通過直接將抗原連接 到固體表面或使用預涂在固體表面的捕獲抗體來實現(xiàn)。通過這個過程主動性，它能夠?qū)⒖乖c樣本中其他非靶向分子分離開來創造性。

夾心法 ELISA是該測定方法中最常用的形式。常規(guī)步驟如下：
1道路、如果供應商未提供預涂該抗體的孔板規模設備，我們則需要將捕獲抗體(即與目標物特異結(jié)合的抗體)通過被動吸附的方式固定在孔板 上(例如，8孔或12孔條紋組裝在與96孔微孔板讀取器兼容的框架上)指導。
2競爭力、將待分析的樣品加入到涂有抗體的板上，使目標抗原被捕獲進一步完善。
3集聚、將固定的目標抗原暴露給與酶(例如辣根過氧化物酶或HRP)偶聯(lián)的檢測抗體。
4調整推進、加入酶的底物狀況，以產(chǎn)生可以測量和定量的信號。

人源纖維連接蛋白(FN)EIA試劑盒 (Takara Bio,美國加利福尼 亞州圣何塞)是一種體外定量測定血清機製、尿液全過程、細胞培養(yǎng)上清液 和其他生物液中可溶性人源 FN 的試劑盒。該試劑盒提供了足夠的試劑和材料參與水平，可用于在 OT-2 平臺上進行 EIA協(xié)議的設(shè)計和驗證大型。

FN 廣泛分布在細胞表面、細胞外基質(zhì)和血漿中，參與細胞基質(zhì)粘 附重要意義、細胞遷移統籌發展、細胞形態(tài)的調(diào)控以及其他細胞功能。Takara 公司 的 FN EIA試劑盒采用兩種抗人源 FN 的鼠單克隆抗體體系，形成抗體- 抗原-抗體夾心復合物：捕獲抗體預涂在含8連管創新科技，檢測抗體與過 氧化物酶結(jié)合。通過將此復合物暴露于過氧化物酶的底物中共創輝煌，可 以產(chǎn)生光度信號，其吸光度與樣品中目標物(即人源 FN) 的數(shù)量成正比進一步。

競爭法 ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay) 通 過 檢測信號干擾來測量抗原的濃度大部分。簡而言之，目標抗原與預涂在 孔板上的參照物(抗原)競爭與酶偶聯(lián)抗體結(jié)合實際需求。樣品中目標抗 原的濃度越高解決方案，參考抗原與抗體結(jié)合的能力就越弱，產(chǎn)生的信號 就越弱善謀新篇。 一些競爭法 ELISA 試劑盒增產，如次本研究中測試的 Tecan 公司的 Cortisol Saliva ELISA, 酶不是由抗體攜帶，而是由參照 物攜帶方法，參照物與目標抗原競爭與抗原-抗體作用行動力。我們在 OT-2 上進行測試另一個的 ELISA 試劑是 Cell Sciences 公司(美國馬 薩諸塞州紐伯里港)的 SARS-CoV-2 替代病毒中和檢測試劑盒， 用于測量 SARS-CoV-2 感染后或?qū)σ呙缃臃N產(chǎn)生的循環(huán)中和抗體切實把製度。中和抗體通過阻斷盤狀病毒融合蛋白的受體結(jié)合域 (recep-tor-binding domain,RBD) 與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (angioten-sin converting enzyme 2,ACE2) 結(jié)合保供，抑制 SARS-CoV-2 進 入細胞。該試劑盒提供預涂的病毒棘蛋白RBD板進行部署，以競爭法ELISA 的形式責任，引入HRP- 偶聯(lián)的ACE2 與中和抗體競爭捕獲RBD。

雖然 ELISA 的設(shè)計方法有很多保護好，但萬變不離其宗組建，他們都遵循相似的工作流程。ELISA 的常規(guī)操作步驟包括試劑移液特點、孵育以及反復洗滌深刻變革，這些步驟可以在 OT-2 上輕松完成。在每個試劑步驟之間會進行連續(xù)的洗滌統籌推進，以去除未結(jié)合的分子方案。為了防止剩余的溶液帶到下一個試劑步驟中，把過量的液體全部吸走非常重要了解情況。Opentrons的8通道移液器可進行高效深入、精準的移液處理，以滿足 ELISA 中試劑移液和洗滌的需求重要的。此外開展研究，可以通過添加 Opentrons 溫控模塊或熱振蕩儀姿勢，以提升自動化功能和滿足實驗中的樣品孵育環(huán)節(jié)(例如設(shè)定為37℃以促進抗原-抗體相互作用)所需的恒溫功能。

材料和方法
圖1-3顯示了在 Opentrons OT-2 上測試的三種 ELISA 的示意圖首要任務，包括試驗步驟概述和甲板布局綠色化。

液體轉(zhuǎn)移是通過8通道移液器進行的。ELISA 孔板使用了一個帶 有裂縫密封的封膜 (BioChromato, 日本藤澤),這樣移液器 的吸頭可以穿過封膜發展，同時在孵育期間防止蒸發(fā)保持穩定。然后，ELISA 板被固定在熱振蕩儀上面向，并按照說明書的要求提供熱力和攪拌 作用(參考表1)支撐作用。在完成實驗后，需要立即手動將 ELISA 孔板移至酶標儀建設項目，并在450 nm 波長處測量吸光度值最為突出。

為了測試 FN EIA 試劑盒，首先將人血漿中的 FN 溶解在去離子水中相結合，制備出1 mg/mL 的儲備溶液高效化，然后進一步稀釋至500 ng/mL 并進行2倍的連續(xù)稀釋。而對于皮質(zhì)醇 ELISA 測試為產業發展，則 使用試劑盒提供的已知皮質(zhì)醇濃度的標準品和控制液範圍和領域。之前已 經(jīng)測試過 SARS-CoV-2 抗體陽性或陰性的血清樣本將被用于病 毒中和 ELISA 實驗。每個實驗在不同樣本量下的運行時間是可預估的(參考表1)服務好。

實驗結(jié)果
將 FN EIAs 在 OT-2 上進行處理新趨勢。可以通過評估最終讀數(shù)與目標分子濃度之間的相關(guān)性以及不同實驗之間這種相關(guān)性的一致性來評估樣本處理質(zhì)量共謀發展。通過繪制平均吸光度 (n=3)與 FN 濃度之間的關(guān)系圖學習，并計算標準偏差，可以確定線性回歸的擬合優(yōu)度市場開拓。

結(jié)果展現(xiàn)了 OT-2 在執(zhí)行該試劑盒的實驗中的準確性和精密度(R平方>0.99,CV<10%) (圖4A), 和重復性(圖4B)措施。使用皮質(zhì)醇的連續(xù)稀釋來測試OT-2上的競爭法 ELISA 。結(jié)果顯示液體處理的一致性 (n=3,CV<10%),在半對數(shù)圖上呈現(xiàn)了試驗讀數(shù)與對數(shù)轉(zhuǎn)換后的樣品濃度之間的優(yōu)秀負線性關(guān)聯(lián) (R 平方>0 .99) ( 圖5A), 并且實驗之間具有可重復性(圖5C)要落實好。

為了檢測競爭法 ELISA 中 ACE2-RBD 結(jié)合的抑制作用緊密相關，血清樣本 在 OT-2 上進行了三次處理，在酶標儀上測量吸光度先進技術，并獲得了變異系數(shù)培訓。結(jié)果再次確認了 OT-2 液體處理的精確性 (CV<10%)(圖6)。根據(jù)廠家的說明書宣講手段，該實驗是有效的重要工具，因為每個控制組 的 OD450 值都在標準范圍內(nèi)(陽性對照<0.3,陰性對照>0.9)。抑制率的計算公式如下：

該實驗成功檢測到先前被診斷為SARS-CoV-2抗體陽性的樣本中能夠中和 ACE2-RBD 相互作用的抗體(表格1)相對開放。

實驗總結(jié)
通過使用 OT-2 進行競爭性 ELISA和中和抗體檢測，我們得出結(jié)論：
1結構、在 OT-2 上進行的稀釋處理和吸光度測量顯示了高度一致的結(jié)果管理，證實了 OT-2 液體處理的精確性和可重復性。
2能力建設、根據(jù)廠家說明書的要求敢於挑戰，實驗的對照組的 OD450 值都在有效范圍內(nèi)，驗證了實驗的有效性建立和完善。
3、利用實驗測量的抑制率參與水平，成功檢測到先前被診斷為SARS-CoV-2 抗體陽性的樣本中存在的中和抗體大型。
4、表格2中的人體血清樣本確認為陽性明確相關要求，進一步證實了其先前 ELISA檢測的結(jié)果重要意義。
綜上所述，該實驗在檢測中和抗體方面表現(xiàn)出優(yōu)越的精確性和可靠性 深化涉外，OT-2 的樣品處理能力足以與傳統(tǒng)手動方法相媲美體系。