分子克隆是合成生物學(xué)的核心具體而言，因為它包括 DNA 的組裝及其在靶宿主中的表達(dá)。然而發展，目前克隆通常是一個手動、耗時且重復(fù)的過程，自動化將極大地促進這一過程的發(fā)展。完整的合理克隆過程（即從 DNA 創(chuàng)建到在靶宿主中表達(dá)）的自動化涉及不同操作和機器的集成引人註目。此類工作流程的示例很少，尤其是當(dāng)設(shè)計合理（即DNA 序列設(shè)計是固定的發展需要，而不是基于隨機庫）且靶宿主在遺傳上不太易于處理（例如攻堅克難，對熱休克轉(zhuǎn)化不敏感）時。在本研究中顯示，介紹了一種自動化工作流程雙向互動，用于合理構(gòu)建質(zhì)粒并將其隨后接合轉(zhuǎn)移到生物技術(shù)平臺生物谷氨酸棒狀桿菌中。整個工作流程都配有定制的軟件工具設計能力。作為應(yīng)用示例品牌，構(gòu)建并表征了基于調(diào)節(jié)器 Lrp 的合理設(shè)計的轉(zhuǎn)錄因子生物傳感器庫。獲得了具有改進的動態(tài)范圍的傳感器更為一致，并且從篩選中獲得的見解為谷氨酸棒桿菌Lrp的雙重調(diào)節(jié)功能提供了證據(jù)等形式。

介紹
大宗和精細(xì)化學(xué)品的微生物生產(chǎn)是實現(xiàn)更可持續(xù)的全球經(jīng)濟的重要組成部分。為了促進這一發(fā)展研究與應用，必須提高對微生物生命的基本理解及其工程設(shè)計以滿足社會需求飛躍。近年來，人們提出了采用設(shè)計-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí) (DBTL) 循環(huán)作為實現(xiàn)這一目標(biāo)的工具全面協議。（1）分子克隆在這一循環(huán)中發(fā)揮著重要作用重要部署，因為它可以生成具有不同特性的新基因型以供探索。
目前已開發(fā)出多種軟件工具來幫助進行基因型的電子克隆新的動力，其數(shù)量很容易超過實驗室中手動克隆的數(shù)量的過程中。（2）現(xiàn)在，在短時間內(nèi)設(shè)計數(shù)百種基因型已成為可能廣泛關註。例如促進進步，一條由 5 個基因組成的生產(chǎn)途徑，每個基因具有 3 個不同的核糖體結(jié)合位點 (RBS)優勢領先，已經(jīng)產(chǎn)生了 3 5 = 243 種變體迎來新的篇章。然而，這種項目的設(shè)計相對簡單推動並實現，現(xiàn)在瓶頸轉(zhuǎn)移到實際體外創(chuàng)建這些序列及其在所需工業(yè)宿主中的表達(dá)薄弱點。（3）
可以通過使用一鍋組裝和篩選方法來解決該問題覆蓋範圍，即獲得許多但不一定是全部的變體，并使用篩選試驗來選擇表現(xiàn)最佳的變體積極性。（4）然而奮勇向前，這些方法有一個缺點：知識僅來自成功構(gòu)建并從一鍋反應(yīng)中分離的少數(shù)變體。更難構(gòu)建的變體在這種反應(yīng)中較少實施體系，因此不太可能篩選出它們的特性組建。對于許多基本的生物學(xué)問題，這不是一個理想的解決方案深度。在這里帶動擴大，合理的菌株構(gòu)建和工作流程所有步驟內(nèi)所有品種的完整可追溯性是必要的，就像經(jīng)典分子克隆所實現(xiàn)的那樣開拓創新。
然而持續發展，目前分子克隆通常是一個手動、耗時且重復(fù)的過程促進善治，自動化將為其帶來巨大好處擴大。（5）合理克隆工作流程的自動化具有多種好處。實驗人員在菌株構(gòu)建上花費的動手時間可以大大減少實事求是。再加上可以實現(xiàn)更高的吞吐量進行探討，這大大增加了可以及時生產(chǎn)的構(gòu)建體的數(shù)量落到實處。此外服務水平，自動化通過消除過程中的隨機變化引入了流程的標(biāo)準(zhǔn)化。這些過程也可以更容易地監(jiān)控和分析技術創新，從而更容易找到改進的空間處理方法。因此，自動化可以提高克隆工作流程的數(shù)量和質(zhì)量持續向好。
近年來習慣，微流體技術(shù)已用于實現(xiàn)克隆過程的自動化。（6,7）在這里進展情況，定制的微流控芯片用于為單個單元操作提供液體分離和液體轉(zhuǎn)移的積極性。雖然這種技術(shù)具有將許多單元操作組合在一個設(shè)備中的優(yōu)勢，并且能夠擴展到每個芯片進行大量實驗明確相關要求，但需要高度專業(yè)的基礎(chǔ)設(shè)施和人員來制造芯片并進行實驗不可缺少。
一種更模塊化新體系、更方便的解決方案是使用標(biāo)準(zhǔn)液體處理系統(tǒng)，如果需要能力建設，還可以使用輔助設(shè)備。這樣的系統(tǒng)可能相當(dāng)復(fù)雜研究進展，能夠執(zhí)行大量具有不同任務(wù)的實驗無障礙，（8?11）而且還有更具成本效益的解決方案可供選擇連日來。（12）最近提出的策略利用特定細(xì)菌的自然轉(zhuǎn)化能力，從而產(chǎn)生一種高效且易于使用的克隆方法認為。（13）然而系統，這種方法僅限于主動吸收外源 DNA 的少數(shù)生物。
迄今為止發(fā)布的大多數(shù)自動克隆工作流程都集中于大腸桿菌更合理。（14）大腸桿菌是一種成熟的分子克隆宿主發展空間，在遺傳學(xué)上非常容易操控。許多遺傳工具已被開發(fā)和優(yōu)化用于大腸桿菌有所應，并且有全面的組學(xué)數(shù)據(jù)可用足了準備。然而，由于大腸桿菌的低壓力耐受性和噬菌體感染風(fēng)險著力提升，它并不總是工業(yè)過程的理想宿主深刻內涵。（15）因此，擴展自動化平臺以涵蓋對其他遺傳上較難處理的微生物進行工程改造將是有益的融合。
谷氨酸棒狀桿菌是一種廣泛使用的工業(yè)細(xì)菌（16）由于其對熱休克轉(zhuǎn)化等自動化友好型轉(zhuǎn)化過程具有抵抗力深入闡釋，因此其改造難度比大腸桿菌更大。雖然已經(jīng)朝這個方向采取了一些措施完成的事情，（17）它們通常無法實現(xiàn)實際目標(biāo)生物轉(zhuǎn)化過程的自動化物聯與互聯，最常見的原因是，電穿孔（針對此類生物的首選方法）不易實現(xiàn)自動化改造層面。
本研究提出了一種完整的工作流程供給，用于自動化合理構(gòu)建抗熱休克微生物菌株。所有工作均使用標(biāo)準(zhǔn)液體處理系統(tǒng)進行經驗分享。PCR 和 Gibson 組裝用于構(gòu)建 96 個質(zhì)粒的文庫解決方案。開發(fā)了用于大腸桿菌熱休克轉(zhuǎn)化的自動化方案作為穿梭系統(tǒng)。菌落 PCR 和測序用作質(zhì)量控制有力扭轉。對于轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌的最后一步上高質量，開發(fā)了一種新穎的高通量接合工作流程。接合是一種描述良好且高度相關(guān)的細(xì)菌轉(zhuǎn)化技術(shù)廣度和深度。（18）這種方法效率很高深入交流，但由于需要使用瓊脂板和濾紙，因此通常比較費力加強宣傳。在本研究中臺上與臺下，我們通過使用離心法簡化了操作并使其自動化。整個工作流程都配有一個定制的軟件工具設計能力，用于跟蹤所有構(gòu)建體及其在過程中的狀態(tài)品牌。
作為應(yīng)用示例，顯示了谷氨酸棒桿菌中不同 Lrp 生物傳感器變體的組裝和表達(dá)更為一致。Lrp 生物傳感器之前已開發(fā)用于檢測谷氨酸棒桿菌中的l -蛋氨酸和支鏈氨基酸應用。(19)該傳感器將細(xì)胞內(nèi)l -蛋氨酸和支鏈氨基酸濃度與eyfp的表達(dá)相結(jié)合建議，后者編碼一種熒光報告蛋白。細(xì)胞內(nèi)濃度增加會導(dǎo)致熒光信號增強相貫通。一般而言不斷發展，生物傳感器的設(shè)計相對模塊化；可以通過修改核糖體結(jié)合位點和啟動子長度等來改變其特性自動化方案。（20,21）此外緊密協作，通過設(shè)計，它們提供了基因型和表型之間的直接且易于測量的關(guān)系線上線下；即Lrp 傳感器設(shè)計的變化可能會導(dǎo)致不同的可測量熒光輸出發揮重要作用。因此，選擇不同 Lrp 生物傳感器的合理設(shè)計作為應(yīng)用示例數據顯示，以展示我們的克隆自動化方法的優(yōu)勢高質量。

結(jié)果與討論
自動化基因工程工作流程
本研究開發(fā)的自動克隆工作流程（圖1）可分為兩個階段：質(zhì)粒在大腸桿菌中的組裝和擴增以及將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到目標(biāo)生物體（本例中為谷氨酸棒桿菌）中。質(zhì)粒的構(gòu)建是通過計算機設(shè)計部件記得牢、通過 PCR 構(gòu)建片段以及通過 Gibson 組裝整合到骨架載體中註入了新的力量。之所以選擇 Gibson 組裝，是因為它允許質(zhì)粒無疤痕組裝更多可能性。(22)隨后通過熱休克轉(zhuǎn)化為大腸桿菌去創新。將所得克隆通過冷凍保存，并通過菌落 PCR 進行第一步質(zhì)量控制緊迫性。之所以選擇這種方法結構，是因為其成本效益高且運行時間短。該菌落 PCR 的結(jié)果影響了接下來的步驟：只有菌落 PCR結(jié)果為陽性的大腸桿菌克隆多元化服務體系，即得到的 DNA 片段具有預(yù)期大小規劃，表明片段成功組裝到主鏈中擴大公共數據，才會被考慮用于自動質(zhì)粒制備深度，并同時結(jié)合到谷氨酸棒桿菌中。純化的質(zhì)粒用于測序作為最終的質(zhì)量控制核心技術體系。之后開拓創新，篩選自動構(gòu)建的菌株以表征改變的特性。最重要的是必然趨勢，每個單元操作都被設(shè)計為獨立的促進善治，因此可以在脫離工作流程時使用。

自動化單元操作由低成本液體處理設(shè)備 Opentrons OT-2 和基于前面描述的 Tecan EVO 200 的更復(fù)雜的液體處理平臺執(zhí)行或支持。（23,24）這兩個系統(tǒng)有著根本的不同：??OT-2 使用兩個帶一次性吸頭的空氣置換移液器進一步完善〖?？捎靡埔浩鞯娜萘糠秶c手動移液器相似，操作員必須選擇適合實驗的移液器調整推進。它沒有機械手狀況；因此，它不能改變平板的位置機製，例如全過程，將平板放在加熱塊上或離心機中。平臺最多可容納九個微量滴定板探討。本研究使用的模型沒有配備冷卻實驗室器皿的選項效果。設(shè)計并 3D 打印了一個可裝滿冰和接頭適配器的定制冷卻架（參見支持信息） ，以便在必要時（例如合規意識，用于 Gibson 組裝）冷卻試劑密度增加。本研究中使用的配置中的 EVO 200 有一個基于液體的液體處理系統(tǒng)，容量范圍為 3 至 990 μL創新內容。它配備了一臺離心機機遇與挑戰、一個冷卻載體和一個加熱器/振動裝置，兩者都可供集成的機器人操縱臂使用善於監督。根據(jù)所用的載體集成技術，該平臺可以容納 15 個或更多的微量滴定板。為了將細(xì)菌培養(yǎng)物點到 100 毫米圓形培養(yǎng)皿上更合理，我們設(shè)計了一個定制適配器并進行了 3D 打舆m應能力。▍⒁娭С中畔ⅲ?br>決定使用兩種不同的液體處理系統(tǒng)是出于最高效利用實驗室設(shè)備的需求：只要有可能各方面，就使用 OT-2 進行單元操作防控。與更昂貴的 EVO 200 相比，這節(jié)省了時間適應性，因此可用于要求更高的實驗堅實基礎。在本研究中，單元操作“菌落采摘”是手動完成的方法。它可以通過專用設(shè)備自動完成行動力，但當(dāng)時沒有這些設(shè)備。
基于轉(zhuǎn)錄因子的生物傳感器的合理組合設(shè)計為了證明我們的工作流程的適用性切實把製度，設(shè)計保供、構(gòu)建并在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)了不同版本的 Lrp 生物傳感器。Lrp 生物傳感器將細(xì)胞內(nèi)l -蛋氨酸進行部署、l -亮氨酸責任、l -異亮氨酸和l -纈氨酸濃度與熒光報告蛋白 eYFP 的表達(dá)相結(jié)合品質。為了構(gòu)建不同版本的 Lrp 生物傳感器，對傳感器的不同部分進行了修改深入各系統。Lrp 生物傳感器由lrp基因（編碼 Lrp 轉(zhuǎn)錄因子）解決問題、發(fā)散表達(dá)的eyfp基因（編碼熒光報告基因）和基因間區(qū)（包含lrp啟動子和eyfp上游的brnF啟動子以及eyfp RBS）組成(19)（圖2 ）針對lrp起始密碼子和 RBS、brnF啟動子和eyfp RBS設(shè)計了不同的變體作用。

對于lrp起始密碼子處理，選擇了三種變體：天然起始密碼子 ATG（應(yīng)導(dǎo)致最高表達(dá)）建設、起始密碼子 GTG（應(yīng)導(dǎo)致較低表達(dá)）和 TGT（應(yīng)導(dǎo)致非常低或無表達(dá)）。這些起始密碼子變體中的每一個都與三種不同的lrp RBS 組合助力各行，同樣從最高表達(dá)到最低表達(dá)：GCTAAAATGG（最強）前來體驗、GCTATTGTGC（天然，較弱）和 CAATCCTACC（最弱）確定性。lrp側(cè)的三個起始密碼子和三個 RBS 的組合產(chǎn)生了 3 × 3 = 9 種不同的引物更加廣闊。
eyfp基因在brnF啟動子的控制下表達(dá)，該啟動子含有 Lrp 蛋白的結(jié)合位點講故事。(25)因此非常完善，當(dāng)啟動子序列縮短或延長時，可以添加或移除結(jié)合位點全面革新。由于brnF轉(zhuǎn)錄為無前導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本作用，并且brnF的第一部分可能具有調(diào)控功能，(26)標(biāo)準(zhǔn)Lrp傳感器的eyfp啟動子包含brnF的前30bp 行業分類。本研究設(shè)計了四種不同的變體最為突出，從+30（標(biāo)準(zhǔn)Lrp生物傳感器啟動子）開始，以15為步長設(shè)計縮短版本講道理，即+15發展目標奮鬥、0和?15。對于eyfp的RBS更多的合作機會，選擇了三種變體：AAAAGGAGAT（最強）、AGAAGGAGAT（天然認為，強度較低）和ATCCGACCAT（最弱）服務好。四種啟動子長度和eyfp側(cè)三種RBS的組合產(chǎn)生了4×3=12種不同的引物。這種設(shè)計策略總共包括9×12=108種不同的Lrp生物傳感器變體反應能力。
每種變體都可以通過單個 PCR 反應(yīng)構(gòu)建共謀發展，并且所有 PCR 反應(yīng)都可以使用相同的 PCR 模板學習，即質(zhì)粒 pJC1- lrp - brnF′ - eyfp。為了組裝生物傳感器質(zhì)粒聽得懂，每個 PCR 反應(yīng)之后都會進行雙片段 Gibson 組裝應用優勢，其中 PCR 產(chǎn)物被組裝到 pEC-Tmob18- lrp - eyfp主鏈中；所有 PCR 產(chǎn)物都經(jīng)過設(shè)計全方位，因此它們可以組裝到相同的主鏈中高效節能。

大腸桿菌的DNA組裝與轉(zhuǎn)化
在構(gòu)建 Lrp 生物傳感器變體之前，通過將lrp和eyfp插入可移動的 pEC-Tmob18 骨架來構(gòu)建骨架質(zhì)粒大局。在兩個基因之間插入一個包含兩個 NcoI 限制位點的短間隔區(qū)新創新即將到來。此序列允許質(zhì)粒線性化，并在下一步中插入包含不同lrp起始密碼子有序推進、lrp RBS設施、brnF啟動子長度和eyfp RBS 的不同版本的序列變體。
108 種變體中堅定不移，96 種被選為自動克隆工作流程的應(yīng)用示例組合運用，因為大多數(shù)自動化設(shè)備都是為 96 孔多滴定板設(shè)計的。PCR 變體構(gòu)建迎難而上、Gibson 組裝和大腸桿菌熱休克轉(zhuǎn)化連續(xù)進行競爭力。Opentrons OT-2 能夠在 85 分鐘內(nèi)自動移液 96 個 PCR 反應(yīng)，然后將平板手動轉(zhuǎn)移到熱循環(huán)儀中進一步完善。熱循環(huán)后集聚，使用 OT-2 混合 96 個 Gibson 組裝反應(yīng)，這需要 50 分鐘調整推進。通過手動將平板轉(zhuǎn)移到熱循環(huán)儀進行孵育哪些領域。在 50 °C 孵育步驟之前對 Gibson 主混合物進行適當(dāng)冷卻至關(guān)重要；否則不斷創新，就無法獲得大腸桿菌轉(zhuǎn)化子建立和完善。在我們的工作流程中，冷卻是通過將所有實驗室器皿放入裝滿冰的 3D 打印小盒子中實現(xiàn)的參與水平。大腸桿菌熱休克轉(zhuǎn)化是在 TECAN EVO200 液體處理機器人上進行的大型，該機器人實現(xiàn)了完全無人操作的過程，從 Gibson 組裝混合物和感受態(tài)細(xì)胞開始明確相關要求，到將細(xì)胞點在瓊脂板上準(zhǔn)備過夜孵育結(jié)束重要意義。這個過程耗時 170 分鐘∩罨嫱?？偣苍?8 小時內(nèi)完成了 96 個構(gòu)建體的 PCR體系、Gibson 組裝和轉(zhuǎn)化，僅需 40 分鐘的手動操作時間。
實施熱激步驟的合適方法是將 V 型底 96 孔板放在加熱裝置上預(yù)熱攜手共進，將 8 種細(xì)胞-質(zhì)凉餐?；旌衔飶睦鋮s載體一次一個地轉(zhuǎn)移到加熱板上，孵育 30 秒經過，然后將其轉(zhuǎn)移回冷卻載體簡單化。雖然將整個板從冷卻載體轉(zhuǎn)移到加熱裝置更快，但這會產(chǎn)生不太可靠的熱傳遞結(jié)果明確了方向。通過離心濃縮細(xì)胞懸浮液系統性，將其重新懸浮在 LB 培養(yǎng)基中，然后點在瓊脂板上增產，即通過在單個瓊脂板的同一行上移取 6 個 5 μL 的點便利性。
此外，使用大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（NEB 5-alpha 感受態(tài)大腸桿菌）和 pUC19 標(biāo)準(zhǔn)載體測試了熱休克轉(zhuǎn)化的參數(shù)行動力。測試了熱休克溫度（37提供有力支撐、42 和 47 °C）和熱休克持續(xù)時間（0 到 30 秒，步長為 5 秒）保供。令人驚訝的是自行開發，在每種條件下都成功轉(zhuǎn)化的情況下，菌落形成單位幾乎沒有差異責任。最終應用情況，選擇了與標(biāo)準(zhǔn)手動程序最相似的條件。