一、二代測(cè)序簡(jiǎn)介
1.第二代測(cè)序（Next-generation sequencing，NGS）：又稱為高通量測(cè)序（High-throughput sequencing）改革創新，是基于PCR和基因芯片發(fā)展而來的DNA測(cè)序技術(shù)開展試點。
2.一代測(cè)序?yàn)楹铣山K止測(cè)序不斷進步，而二代測(cè)序開創(chuàng)性的引入了可逆終止末端保供，從而實(shí)現(xiàn)邊合成邊測(cè)序高效節能。
3.二代測(cè)序在DNA復(fù)制過程中通過捕捉新添加的堿基所攜帶的特殊標(biāo)記（一般為熒光分子標(biāo)記）來確定DNA的序列影響力範圍。

4.現(xiàn)有的技術(shù)平臺(tái)主要包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等核心技術。
5.由于在二代測(cè)序中應用提升，單個(gè)DNA分子必須擴(kuò)增成由相同DNA組成的基因簇，然后進(jìn)行同步復(fù)制創造性，來增強(qiáng)熒光信號(hào)強(qiáng)度從而讀出DNA序列發展的關鍵；而隨著讀長(zhǎng)增長(zhǎng)，基因簇復(fù)制的協(xié)同性降低性能，導(dǎo)致堿基測(cè)序質(zhì)量下降多種方式，目前二代最長(zhǎng)的讀長(zhǎng)是miseq的600bp。
6.二代測(cè)序適合擴(kuò)增子測(cè)序（例如16S技術創新、18S深入交流研討、ITS的可變區(qū)）資料，而基因組、宏基因組DNA則需要使用鳥槍法打斷成小片段關註度，測(cè)序完畢后再使用生物信息學(xué)方法進(jìn)行拼接橫向協同。
鳥槍法：將大分子的目標(biāo)DNA隨機(jī)地處理成大小不同的小片段進(jìn)行測(cè)序，并在后續(xù)的生物信息學(xué)分析中將這些短序列組裝成目標(biāo)DNA的技術(shù)方法敢於挑戰。
傳統(tǒng)方法：使用限制性內(nèi)切酶對(duì)目標(biāo)DNA上的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行切割不斷創新，從而形成小片段。
常用方法：使用機(jī)械法（例如超聲波DNA破碎）使大分子DNA形成在一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)分布的短序列片段提供了遵循。

二參與水平、代測(cè)序的背景和特點(diǎn)
1.2005年，羅氏推出了第一款二代測(cè)序儀羅氏454服務效率，生命科學(xué)開始進(jìn)入高通量測(cè)序時(shí)代明確相關要求。
2.隨著Illumina系列測(cè)序平臺(tái)的推出，極大降低了二代測(cè)序的價(jià)格統籌發展，推動(dòng)了高通量測(cè)序在生命科學(xué)各個(gè)研究領(lǐng)域的普及深化涉外。
3.特點(diǎn)：通量高、讀長(zhǎng)短

三生產製造、NGS實(shí)驗(yàn)步驟
1.核酸提取與檢測(cè)
2.文庫(kù)構(gòu)建與文庫(kù)檢測(cè)
3.上機(jī)測(cè)序

原理：
從細(xì)胞中分離得到的DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA服務延伸，其中還含有大量RNA，即核糖核蛋白具有重要意義。利用DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液而RNA能溶于0.14mol/L的NaCl溶液這一性質(zhì)可以將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品破碎細(xì)胞液中分開。分離得到核蛋白后大部分，還需進(jìn)一步將蛋白等雜質(zhì)除去強大的功能。
去除蛋白的方法有3種：
①用含辛醇或異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液，使其乳化解決方案，然后離心除去變性蛋白質(zhì)優勢。用這種方法處理時(shí)，蛋白質(zhì)停留在水相和氯仿相中間增產，而DNA則溶于上層水相便利性，用兩倍體積95%乙醇溶液可將DNA鈉鹽沉淀出來。
②用十二烷基硫酸鈉(SDS)等去污劑使蛋白質(zhì)變性高產，從而使其與核酸分離信息化技術，也可從材料中直接提取出DNA。
③用苯酚處理良好，然后離心分層逐步顯現，一樣可以將DNA+與蛋白質(zhì)分離開來。這時(shí)DNA溶于上層水相引領，蛋白變性后則停留在酚層內(nèi)自動化裝置，吸出上層水相示範，加入兩倍體積的95%乙醇即可得到白色纖維狀DNA沉淀。反復(fù)使用上述方法多次處理DNA核蛋白溶液有很大提升空間，就能將蛋白等雜質(zhì)較徹底地除去運行好，得到較純的DNA制品。

磁珠吸附法可能性更大、過柱收集法DNA提取步驟
?細(xì)胞裂解
?去除雜質(zhì)
?回收DNA
?清洗溶解DNA

2.文庫(kù)構(gòu)建與文庫(kù)檢測(cè)
NGS文庫(kù)構(gòu)建：DNA片段加接頭修飾的過程部署安排。
以試劑盒NEBNext?Ultra?II DNA Library Prep Kit for Illumina?為例

具體步驟：
①末端修飾：
1.使用Tap聚合酶補(bǔ)齊不平的末端
2.并在兩個(gè)末端添加突出的堿基A，從而產(chǎn)生粘性末端（若使用Tap酶擴(kuò)增關鍵技術，則無需末端修飾）
3.產(chǎn)生粘性末端的片段可以添加接頭（Adaptor）

②添加接頭：
1.經(jīng)過末端修飾后的PCR片段末端具有突出的A尾了解情況，而接頭具有突出的T尾，可以使用連接酶將接頭添加到DNA片段兩端技術研究。
2.NEB的接頭為特殊的堿基U鏈接的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（可以增強(qiáng)穩(wěn)定性）重要的，因此連接接頭后，還需要將堿基U刪除從而形成"Y"型接頭姿勢。
3.上一步添加的接頭主要是為了后續(xù)PCR中作為引物擴(kuò)增繼續(xù)添加文庫(kù)index和與測(cè)序平臺(tái)互補(bǔ)的寡核苷酸序列（此外還作為測(cè)序引物Rd1 SP/Rd2 SP）.
4.之所以為"Y"型開叉結(jié)構(gòu)相互融合，是因?yàn)槊恳欢私宇^是兩條不互補(bǔ)的序列（每一端都是Rd1 SP與Rd2 SP交錯(cuò)），連接酶沒有選擇性綠色化，每個(gè)接頭都是只靠突出來的T與DNA鏈接不同需求，"Y"接頭保證了每條單序列均為不同的測(cè)序引物，從而在后續(xù)PCR中可以連接不同的管核苷酸序列（P5/P7）保持穩定。

③磁珠純化：
添加接頭后的文庫(kù)體系中含有聚合酶總之、連接酶等各種酶以及輔助物質(zhì)，接頭的添加也是過量的支撐作用，而且由于末端的不穩(wěn)定性研學體驗，容易形成自連片段，鳥槍法打斷的片段中也可能有大片段存在最為突出，所以需要特殊磁珠（AMPure XP Beads）純化來去除大片段以及各種雜志模式，從而獲得成功添加接頭的文庫(kù)片段。
1.原理：磁珠可以通過氫鍵等作用力來吸附DNA片段提升，磁珠本身不具有片段大小選擇的能力高品質，但其儲(chǔ)存的buffer里面還有20%的PEG 8000，PEG濃度越大則可以吸附的DNA片段越小支撐能力。
2.注意事項(xiàng)：磁珠純化的時(shí)候要根據(jù)文庫(kù)片段不同嚴(yán)格控制磁珠添加量（實(shí)際上就是PEG添加量）來實(shí)現(xiàn)片段選擇資源優勢。

④PCR擴(kuò)增：
1.添加了接頭的DNA片段，可以使用與接頭互補(bǔ)的引物來擴(kuò)增大數據。
2.片段還需要添加用于區(qū)分不同文庫(kù)的特異性index長效機製，以及與測(cè)序儀芯片互補(bǔ)的兩種寡核苷酸序列（P5/P7）。

⑤第二次磁珠純化：
1.PCR后需要將產(chǎn)物DNA片段與聚合酶等雜質(zhì)分離數字技術，因此再次進(jìn)行磁珠純化奮戰不懈。
2.之后進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)市場開拓，包括DNA濃度檢測(cè)、瓊脂糖凝膠電泳和片段長(zhǎng)度檢測(cè)大大縮短，完成建庫(kù)要落實好。