現(xiàn)代數(shù)據(jù)分析方法（例如優(yōu)化算法或深度學(xué)習(xí)）已成功應(yīng)用于許多生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)問(wèn)題。為了使這些方法有效提升，需要進(jìn)行大量高質(zhì)量且可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)醒悟，這需要高度自動(dòng)化。在這里應用擴展，我們介紹了一種開(kāi)源硬件和低成本框架更多可能性，可以自動(dòng)高通量生成大量細(xì)胞生物學(xué)數(shù)據(jù)。我們的設(shè)計(jì)包括一個(gè)落射熒光顯微鏡調解製度，該顯微鏡帶有自動(dòng) XY 載物臺(tái)全面革新，用于移動(dòng)裝有細(xì)胞的多孔板作用，以及一個(gè)灌注歧管，允許編程應(yīng)用多達(dá)八種不同的溶液行業分類。我們的系統(tǒng)非常靈活技術特點，可以輕松適應(yīng)個(gè)人實(shí)驗(yàn)需求。為了證明該系統(tǒng)的實(shí)用性發展邏輯，我們已使用它進(jìn)行高通量 Ca 2+成像和大規(guī)模熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)凝聚力量。

介紹
過(guò)去十年發(fā)展起來(lái)的深度學(xué)習(xí)和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (ANN) 已被證明可用于圖像分析、優(yōu)化任務(wù)和機(jī)器人技術(shù)（LeCun 等人聽得進，2015 年新的力量；Hinton，2018 年便利性；Hinton 等人全面展示，2019 年）。它們?cè)诮鉀Q生物問(wèn)題方面也越來(lái)越受歡迎深刻認識。例如結構，基于 ANN 的細(xì)胞分割算法比傳統(tǒng)方法更準(zhǔn)確、更快（Hilsenbeck 等人高效，2017 年）。深度學(xué)習(xí)還有助于檢測(cè)人體組織中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞（Van Valen 等人高質量發展，2016 年全方位；Coudray 等人，2018 年）影響力範圍、優(yōu)化治療條件（Kusumoto 和 Yuasa大局，2019 年）以及解釋動(dòng)物行為（Heras 等人，2019 年）邁出了重要的一步。最近有序推進，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一個(gè)在線(xiàn)平臺(tái)，讓沒(méi)有任何深度學(xué)習(xí)知識(shí)的研究人員可以在自己的應(yīng)用程序中使用它（von Chamier 等人需求，2020 年）堅定不移，進(jìn)一步提高了深度學(xué)習(xí)作為分析工具的實(shí)用性。

應(yīng)用深度學(xué)習(xí)和其他機(jī)器學(xué)習(xí)方法時(shí)更讓我明白了，一個(gè)重要的考慮因素是訓(xùn)練數(shù)據(jù)集的大小迎難而上。通常，深度學(xué)習(xí)需要數(shù)千到數(shù)萬(wàn)個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)（O'Mahony 等人，2019 年）堅持先行。這在生物實(shí)驗(yàn)中通常是不可行的產業，因?yàn)樗鼈兺ǔＰ枰荛L(zhǎng)時(shí)間才能完成。因此情況較常見，需要能夠在最少的人工監(jiān)督下執(zhí)行數(shù)百或數(shù)千個(gè)實(shí)驗(yàn)的自動(dòng)化系統(tǒng)可持續。這種自動(dòng)化系統(tǒng)應(yīng)允許 (a) 在多個(gè)孔中進(jìn)行單細(xì)胞顯微鏡檢查（明場(chǎng)和/或熒光）（即具有 XY 載物臺(tái)）；(b) 自動(dòng)應(yīng)用多種不同的解決方案體製；(c) 自動(dòng)在線(xiàn)分析（例如構建，細(xì)胞分割和平均亮度的計(jì)算）。

市售熒光顯微鏡（例如 Olympus BX61探討、Nikon Ti Widefield 或 Nikon A1 共聚焦系統(tǒng)不負眾望，以及活細(xì)胞成像系統(tǒng)，例如 Echo Revolve 或 Sartorius Incucyte）通常配備 XY 載物臺(tái)調解製度，可進(jìn)行多孔熒光成像精準調控。然而，這些系統(tǒng)價(jià)格昂貴（15,000-150,000 英鎊）應用的因素之一，并且僅提供有限的自動(dòng)化解決方案應(yīng)用功能解決。許多市售系統(tǒng)（例如 Hamilton 或 Andrew）都允許這樣做，但由于其尺寸和成本敢於監督，這些系統(tǒng)很難與實(shí)時(shí)成像相結(jié)合攜手共進。

3D 打印以及 Arduino 和 Raspberry Pie 等廉價(jià)電子設(shè)備的發(fā)展引發(fā)了定制經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的科學(xué)設(shè)備的革命，而這些設(shè)備以前只能在大型實(shí)驗(yàn)室或大學(xué)設(shè)施中使用推進一步。這些設(shè)備不僅經(jīng)濟(jì)實(shí)惠經過，而且可以根據(jù)各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的需求進(jìn)行定制。此類(lèi)技術(shù)的一個(gè)例子是Baden 等人（2015 年）和Maia Chagas 等人（2017 年）開(kāi)發(fā)的labware.net力度，它允許 3D 打印極其便宜的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備明確了方向，從標(biāo)準(zhǔn)可用的微量移液器和微操作器到熒光顯微鏡和光遺傳學(xué)解決方案。

最近開(kāi)發(fā)了幾種開(kāi)源高質(zhì)量顯微鏡勇探新路。例如單產提升，Diederich 等人 (2020)開(kāi)發(fā)了一個(gè)可定制的 3D 打印開(kāi)源框架，可用于構(gòu)建各種顯微鏡：從具有自動(dòng)對(duì)焦功能的簡(jiǎn)單明場(chǎng)顯微鏡到具有樣品光學(xué)切片功能的更復(fù)雜的系統(tǒng)試驗。然而勞動精神，這些資源缺乏用于掃描大量樣本的開(kāi)源系統(tǒng)。Sharkey 等人(2016)針對(duì)小動(dòng)作解決了這個(gè)問(wèn)題製度保障，Merces 等人 (2021)針對(duì)多孔板的穩(wěn)健成像解決了這個(gè)問(wèn)題預下達。然而，這些解決方案不提供任何細(xì)胞操作統籌推進，盡管最近已經(jīng)開(kāi)發(fā)了開(kāi)源液體處理解決方案（例如責任，Wijnen 等人，2014 年；Almada 等人組建，2019 年新模式；Amarante 等人線上線下，2019 年；Booeshaghi 等人，2019 年新型儲能；Samokhin效高，2020 年善謀新篇；Baas 和 Saggiomo探索，2021 年）。

在這里先進的解決方案，我們介紹了一個(gè)開(kāi)源系統(tǒng)拓展，該系統(tǒng)結(jié)合了多孔板中的高通量顯微鏡、自動(dòng)化溶液應(yīng)用宣講活動、同步熒光成像和圖像分析不斷進步。它成本低（不帶熒光顯微鏡的價(jià)格為 400-600 英鎊，帶熒光顯微鏡的價(jià)格為 2,500 英鎊）豐富內涵，完全可定制生產效率，并且最多可以連續(xù)進(jìn)行 96 或 384 個(gè)實(shí)驗(yàn)，如果實(shí)驗(yàn)不需要高采樣率（例如每分鐘 1 幀或更高）適應性，則可以同時(shí)進(jìn)行節點。該平臺(tái)配備一個(gè)單通道落射熒光顯微鏡頭，可用于對(duì)動(dòng)態(tài)熒光報(bào)告基因（例如 GCaMP 和合成鈣染料落地生根；Razlivanov 等人的特點，2018 年）和/或用熒光抗體或染料標(biāo)記的樣品進(jìn)行成像。我們展示了我們的系統(tǒng)如何在嚴(yán)格控制和可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)條件下大規(guī)挠行ПＵ?？焖偕杉?xì)胞生物數(shù)據(jù)最為突出。

結(jié)果
典型的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)范例通常涉及用生物活性化合物（例如生長(zhǎng)因子、鈣動(dòng)員激動(dòng)劑和細(xì)胞毒性劑）處理細(xì)胞相結合，并使用熒光報(bào)告基因監(jiān)測(cè)細(xì)胞行為或固定細(xì)胞以便隨后進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記或基因表達(dá)分析。為了使此類(lèi)實(shí)驗(yàn)自動(dòng)化製高點項目，我們開(kāi)發(fā)了一個(gè)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)為產業發展，該平臺(tái)允許自動(dòng)對(duì) 96 孔板進(jìn)行成像并使用注射泵應(yīng)用八種溶液。我們首先介紹該平臺(tái)并展示其適用性有所增加，然后更詳細(xì)地描述硬件各項要求、軟件和系統(tǒng)性能。

自動(dòng)化平臺(tái)及其適用性
完整組裝的系統(tǒng)如圖1A所示越來越重要的位置。硬件由幾個(gè)主要模塊組成：水平移動(dòng)多孔板的 XY 平臺(tái)新技術；帶有自動(dòng)對(duì)焦系統(tǒng)的小型熒光顯微鏡（補(bǔ)充視頻 1）；以及將八種溶液應(yīng)用到各個(gè)孔中的灌注歧管（補(bǔ)充視頻 2）。構(gòu)建說(shuō)明和所有 3D 打印文件可在https://github.com/frescolabs/FrescoM獲得（另見(jiàn)補(bǔ)充文本）深入⌒Ц?？梢允褂?Python 編寫(xiě)的用戶(hù)界面操作硬件（圖 1B，有關(guān)詳細(xì)信息基礎，請(qǐng)參閱“軟件”部分）性能，該界面控制平臺(tái)、物鏡和歧管以及自動(dòng)對(duì)焦對外開放、曝光技術創新、照明和實(shí)驗(yàn)方案的整體管理。

為了展示該平臺(tái)研究，我們首先演示了它如何用于大規(guī)模熒光成像實(shí)驗(yàn)（Nasu et al., 2021）高效。涉及熒光報(bào)告基因的典型實(shí)驗(yàn)方案需要在應(yīng)用激動(dòng)劑、生長(zhǎng)因子或其他活性化合物之前和之后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行一段時(shí)間的成像提高。為了證明開(kāi)發(fā)的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)對(duì)這種實(shí)驗(yàn)范式的可用性機構，我們使用合成的鈣濃度熒光指示劑進(jìn)行了鈣成像。細(xì)胞自動(dòng)用熒光鈣染料 Fluo4-AM 標(biāo)記（圖 1C）交流，并響應(yīng) 100 μm ATP 進(jìn)行鈣成像基礎。然后使用 Cellpose 算法（Stringer et al., 2021 ）自動(dòng)分割細(xì)胞（圖 1C 提供堅實支撐，右） ，并提取單個(gè)細(xì)胞的熒光動(dòng)力學(xué)（圖 1D）高產。然后在其他 30 個(gè)孔中自動(dòng)重復(fù)相同的實(shí)驗(yàn)程序和分析（圖 1E信息化技術、F和補(bǔ)充視頻 3）。這些實(shí)驗(yàn)表明明確了方向，開(kāi)發(fā)的平臺(tái)可以實(shí)現(xiàn)熒光報(bào)告基因的穩(wěn)健和自動(dòng)高通量成像系統性。

所開(kāi)發(fā)系統(tǒng)的另一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)是它允許在大量孔中大規(guī)模生成圖像。 為了證明這種可用性單產提升，我們生成了一個(gè) Python 協(xié)議類(lèi)（補(bǔ)充協(xié)議 1就此掀開，有關(guān)詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱“軟件”部分）今年，使平臺(tái)在所有 96 個(gè)孔上移動(dòng)穩步前行，對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行聚焦，并捕獲明場(chǎng)或熒光圖像動手能力。 此類(lèi)實(shí)驗(yàn)的示例如圖2A逐步改善、B所示。 重要的是提升，該系統(tǒng)允許掃描單個(gè)孔并對(duì)同一個(gè)孔生成多張圖像（圖 2C）大大提高，這對(duì)于尋找稀有細(xì)胞（例如，正在進(jìn)行有絲分裂/凋亡的細(xì)胞或轉(zhuǎn)染效率低下的陽(yáng)性細(xì)胞）很有用研究成果。

為了證明所開(kāi)發(fā)的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)在標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中的可用性，我們使用了熒光小麥胚芽凝集素 (WGA)豐富內涵，該物質(zhì)可突出顯示細(xì)胞膜。用 PBS 自動(dòng)清洗五排孔（共 48 個(gè)孔）產能提升，然后加入含有 5 mg/ml 熒光 WGA 的溶液適應性。室溫下放置 10 分鐘后節點，用 PBS 清洗 WGA，然后放入熒光顯微鏡下觀察落地生根。得到的熒光圖像如圖2D所示的特點。自動(dòng)標(biāo)記可產(chǎn)生具有明確質(zhì)膜的細(xì)胞的清晰圖??像，從而表明可以使用所開(kāi)發(fā)的平臺(tái)自動(dòng)執(zhí)行常規(guī)標(biāo)記程序有效保障。

最后系統，我們還測(cè)試了所開(kāi)發(fā)的平臺(tái)是否可用于以抗 HER2 抗體（Herceptin）為一抗、以 Alexa 488 偶聯(lián)的二抗進(jìn)行免疫熒光染色進一步提升。用 PBS 和 Herceptin 自動(dòng)灌注含有 SKBR3 細(xì)胞（HER2 高表達(dá)）或 HeLa 細(xì)胞（HER2 低表達(dá)）的孔空間廣闊。室溫下孵育 40 分鐘后，用 PBS 灌注細(xì)胞改革創新，然后用二抗灌注知識和技能。室溫下再孵育 30 分鐘后，用成像溶液灌注孔并進(jìn)行熒光成像（圖 2E和補(bǔ)充圖 1）新模式。得到的圖像顯示實現，HER2 水平高的 SKBR3 細(xì)胞的細(xì)胞膜標(biāo)記清晰，但受體水平低的 HeLa 細(xì)胞的細(xì)胞膜標(biāo)記不清晰組織了，從而證明了自動(dòng)標(biāo)記程序的穩(wěn)健性服務體系。

這些示例證明了所開(kāi)發(fā)的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)在不同類(lèi)型的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)自動(dòng)化方面的廣泛可用性。下面搶抓機遇，我們將詳細(xì)描述該平臺(tái)并在一系列測(cè)試中展示其性能分析。

硬件設(shè)計(jì)
整體結(jié)構(gòu)由 MakerbeamXL 15 毫米 × 15 毫米擠壓件構(gòu)成，通過(guò) L 形和 T 形鋁制支架或 3D 打印部件連接全會精神。我們發(fā)現(xiàn)使用鋁擠壓框架代替完全 3D 打印部件（兩種型號(hào)均可在https://github.com/frescolabs/FrescoM上找到）可以使整個(gè)系統(tǒng)更穩(wěn)定并減少振動(dòng)（未顯示數(shù)據(jù)）系統穩定性。框架由八個(gè)側(cè)面擠壓件組成（四個(gè)垂直 300 毫米和三個(gè)水平 200 毫米集中展示，兩個(gè)在頂部實力增強，一個(gè)在底部，圖 3A）探索創新。側(cè)面與兩個(gè) 400 毫米擠壓件相連帶來全新智能，用于固定驅(qū)動(dòng)x軸的 MGH12 導(dǎo)軌。y軸（圖 3B）位于由四個(gè) 200 毫米擠壓件構(gòu)成的方形框架上新產品，并通過(guò)兩個(gè) 3D 打印支架連接到x軸去完善。兩個(gè) MGH12 導(dǎo)軌位于框架上，可容納一個(gè) Nema 17 電機(jī)和一個(gè) 96 孔板支架（圖 3B長遠所需，y_plate_holder.stl 文件）求索。