摘要三個(gè)圖書館準(zhǔn)備工具包-Illumina?DNA準(zhǔn)備工具包發揮效力，KAPA?超級準(zhǔn)備工具包和NEBNext?Ultra?II試劑盒-都是透過Opentrons OT-2自動快速和穩(wěn)健地製備下一代定序的高品質(zhì)文庫。從lambda和人類基因組DNA中製備了100 ng輸入的文庫。觀察到庫的類似性能基礎，用OT-2上的三個(gè)套件準(zhǔn)備的樣本變異性和產(chǎn)量保護好。類似的排序指標(biāo)選擇適用，如條碼平衡和序列比對也觀察到覆蓋範(fàn)圍。

介紹DNA文庫的製備是下一步工作的關(guān)鍵步驟代定序（NGS）充分發揮。自動化的DNA文庫製備為建構(gòu)高產(chǎn)量定序文庫提供了一種簡化的方法同時(shí)盡量減少實(shí)際操作時(shí)間。在這裡流動性，我們描述海百合DNA製備自動化的效率裝備(伊利鍛造，CatNo。20018705)持續創新，KAPA超級試劑盒(羅氏?. , CatNo.7962363001)和NEBNext超II試劑盒(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室?. , CatNo .E7645L)在OT-2機(jī)器人液體處理平臺上改善。

材料與方法Illumina DNA製備試劑盒、KAPA超級製備試劑盒協調機製、NEBNext Ultra II和視中心OT-2平臺概述擁有專利NGS標(biāo)記工作流程信息化，利用珠聯(lián)轉(zhuǎn)座體，這不同於KAPA HyperPrep和NEBNext Ultra II工作流程-DNA末端修復(fù)和a尾的解決流程實踐者。

對於Illumina DNA準(zhǔn)備試劑盒取得明顯成效，使用OT-2上的雙索引適配器對DNA進(jìn)行標(biāo)記和標(biāo)記。 DNA樣本（n=8,100 ng）量化數據，歸一化到一個(gè)4 nM的庫創新的技術，匯集到一個(gè)多路復(fù)用的樣本，然後在一個(gè)2x75上運(yùn)行在Illumina MiSeq上的流式細(xì)胞進(jìn)行基因組測序顯著。工作流程包括產(chǎn)生DNA準(zhǔn)備庫Lambda（n=24）和人類基因組DNA樣本（n=8）快速增長。

對於HyperPrep和NEBNext Ultra II DNA製備試劑盒，我們在OT-2上建構(gòu)了抗體DNA片段（n=8,100 ng）的DNA文庫性能。使用的條碼來自KAPA獨(dú)特的雙索引適配器初步建立，和NEB多重雙索引II為NEBNext索引設(shè)定1。樣本被定量供給、歸一化的方法，並彙集到一個(gè)4 nM的文庫中，並在一個(gè)帶有2x75的MiSeq上進(jìn)行測序流路池該工作流程包括為=片段DNA（n=24）和人類基因組DNA（ n=8）產(chǎn)生文庫進行探討。

定序資料由Illumina公司進(jìn)行解復(fù)用基本空間?根據(jù)適配器的條碼序列落到實處，並與參考基因組對齊。利用Geneious技術(shù)對此基因組的覆蓋圖譜進(jìn)行了分析?主要的2021.2.21. 我們的數(shù)據(jù)顯示了較低的樣本變異性和在OT-2上使用DNA製備試劑盒製備的文庫的可靠一致性再獲。

OT-2工作流程協(xié)定的原理圖

對於Illumina的DNA準(zhǔn)備試劑盒，DNA和IDT?為了伊利DNA/RNA UD指數(shù)集A應用擴展。 .在OT-2上進(jìn)行了標(biāo)記（圖1）體驗區。 A清洗步驟是必要的，以去除殘留的DNA和適配器接下來活動上，使用具有可編程蓋子和塊溫度的OT-2甲板上熱循環(huán)器進(jìn)行PCR擴(kuò)增有望。

對於HyperPrep和NEBNext Ultra II DNA製備試劑盒，都以NEB片段酵素進(jìn)行片段化導向作用。人類16分鐘方案，人類20分鐘基因組DNA應用的選擇，然後用AMPure進(jìn)行清理?XP珠子(貝克曼庫爾特，CatNo左右。.A63881).對OT-2進(jìn)行DNA末端修復(fù)/A尾跡背景下，然後是AMPure XP珠子清理步驟、條碼或適配器連接（圖1）可靠保障。使用的條碼來自KAPA獨(dú)特的雙索引適配器(羅氏自然條件，CatNo。08861919702). 對於HyperPrep和NEB多重雙索引引子集1 (NEB開展，CatNo互動互補。E7335L)為NEBNext Ultra II。 .

使用甲板上的熱循環(huán)器在OT-2上進(jìn)行DNA擴(kuò)增意向。

工作流程佈局Opentrons OT-2平臺的佈置包括模組意料之外、實(shí)驗(yàn)室軟體和DNA準(zhǔn)備試劑（圖2）。雖然工作流程包括在OT-2上的自動移液形式，但需要手動幹預(yù)置之不顧，在甲板上的恆溫器和磁塊之間移動樣品板，並在此期間重置移液管尖端架協(xié)議連日來。

圖2：OT-2甲板佈局

模組快速融入，實(shí)驗(yàn)室軟體，和DNA準(zhǔn)備試劑系統。這個(gè)

標(biāo)準(zhǔn)化的甲板佈局與HyperPrep和其他平臺共享

NEB下一個(gè)Ultra II增強。此工作流程在OT-2上自動移液，需要手動幹預(yù)在甲板上恆溫筆和之間移動樣品板(1)

磁性磁塊(2)交流等，以及在運(yùn)作過程中重置尖端機(jī)架更加廣闊。甲板佈局包括1個(gè)NEST 12井儲層，1 x 96井鋁塊提高，1個(gè)熱循環(huán)器上的200μl PCR板可以使用，溫度模組上的1個(gè)NEST0.1 mL PCR板(3)。模組包括一個(gè)磁性模組紮實、溫度模組效高化、熱循環(huán)器模組，以及P20和P300 8通道移液管投入力度。

結(jié)果DNA文庫擴(kuò)增使用PicoGreen檢測DNA文庫?在一個(gè)量子位元?4.用螢光計(jì)測定濃度創造。 CV（變異係數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)差除以平均值）。所有文庫的最終洗脫體積均為30μL貢獻法治。對於使用Illumina準(zhǔn)備的庫DNAPrep（n=8,100ng）的CV為10.7%（n=24,100 ng）的CV為16.6%（表1A）設備製造。為文庫使用HyperPrep製備，CV為（n=8100ng）的13.4%攻堅克難，（n=24100ng）的CV為17.6

. 1B)使用NEBNext Ultra II製備的文庫顯示（=8）的CV為12.1%管理，（=24）的CV為14.5%（表1C)顯示。在OT-2上製備的lambda和人類DNA文庫的產(chǎn)量（ng/μl）、CV（%）和片段大行屎桶?。╞p）的比較見表2設計能力。

DNA製備文庫的小基因組定序多路復(fù)用的DNA準(zhǔn)備文庫(n=8,100在Illumina上使用2x75流動細(xì)胞進(jìn)行定序MiSeq儀器。第二批DNA準(zhǔn)備文庫（n=24,100 ng）在OT-2上的3個(gè)單獨(dú)的欄位中進(jìn)行處理範圍，以解釋一批內(nèi)的任何柱間變異性求得平衡。

以DNA製備文庫的片段大小來確定在OT-2上製備的文庫的可靠均勻性（表3A-3C）。同樣空間廣闊，在OT-2上建構(gòu)的48 kb基因組的一致定序覆蓋顯示了8倍路DNA製備文庫的一致性（表4）至關重要。

條碼平衡是準(zhǔn)確的DNA準(zhǔn)備樣本顯示的平均11.2%–12.31%的伊利米納DNA Prep，KAPA HyperPrep的10.6%–14.1%服務品質，NEBNextUltraII的10.5%–14.6%（圖3）.比較DNA製備試劑盒的尖端分配和OT-2方案的持續(xù)時(shí)間（表5）技術發展。

結(jié)論我們驗(yàn)證了免疫DNA準(zhǔn)備，KAPA超準(zhǔn)備集成，和NEBNext Ultra II在OT-2和展示了它在下一代定序的文庫製備中的應(yīng)用重要手段。我們發(fā)現(xiàn)，DNA Prep樣本在複製和化學(xué)中表現(xiàn)出低可變性穩定性，甚至樣本條碼平衡像一棵樹，並且高序列比對的覆蓋範(fàn)圍，表明OT-2可以用來可靠地自動化製備高品質(zhì)的DNA文庫去突破。

原文網(wǎng)址：使用DNA製備試劑盒自動製備小基因組的文庫