應(yīng)用介紹2020年新冠病毒肆虐全球，激化了人類對於臨床研究目的的高通量 RNA 檢測和基因定序的需求。傳統(tǒng)手動操作方案難以提升RNA 檢測的效率建議。在本項(xiàng)研究中生產效率，我們展示了在 Opentrons OT-2 自動化移液工作站上使用 Beckman Coulter Life Sciences RNAd- vance Viral 試劑盒 (C63510) 的自動化 SARS-CoV-2 RNA 萃取工作流程使命責任。 我們提供的分析數(shù)據(jù)顯示了透過 qRT-PCR 定量的SARS-CoV-2 檢測極限(LoD) 和序列比對數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)為自動定序樣本和文庫製備提供了依據(jù)使用，以便對突變株進(jìn)行遺傳鑑定情況較常見。

RNAdvance 病毒試劑盒和 OT-2 平臺概述RNAdvance Viral kit 透過利用 SPRI 順磁珠技術(shù)，從樣本中高效提取病毒RNA主要抓手。 我們在自動化的Opentrons 平臺上使用了這種試劑體製，從合成鼻基質(zhì)(110mM NaCl,1%w/v的豬胃I 型黏液(Sigma M2378-100G) 和10μg/mL w/v人類基因組DNA(Coriell NA12878), 以90%v/v 的TE/SNM) 樣本中提取了不同濃度的熱滅活的SARS-CoV-2(ATCC°VR-1986HKTM) 。 每個濃度包括20 個測試樣本創新科技、2個陽性對照和2個陰性對照服務延伸。

工作流程吞吐量圖1顯示了自動化 RNAdvance 病毒提取工作流程的 OT-2甲板佈局。此工作流程從向樣品裂解液中添加 Bind (BBB)開始具有重要意義，每個樣 品僅需要消耗10個吸頭進一步，可靈活運(yùn)行8個批次大小的最多96個樣本。報(bào)告中所述的工作流程持續(xù)時間包括實(shí)際操作時間強大的功能、樣品裂解時間和優(yōu)化後樣品的運(yùn)行時間(圖2)實際需求。使用RNAdvance Viral試劑盒和OT-2平臺，處理96個樣本的工作流程總共需要3.5小時預期，您可以複製連結(jié)到瀏覽器敢於監督，查看特定協(xié)議流程： https://protocols.opentrons.com/protocol/bc- rnadvance-viral。您可以根據(jù)您的需求靈活地改變方法變量結構，以獲得您所需的批次大小重要的作用、樣品輸入和洗脫體積的所需結(jié)果貢獻。

此工作流程在  OT-2 上是可以全自動運(yùn)作  的穩中求進，每個樣本使用10個吸頭統籌，並從加入Bind(BBB)    開始。實(shí)驗(yàn)甲板上耗材內(nèi)容有：最多10個吸頭架協同控製、1個 NEST 單孔儲液槽振奮起來、2個 NEST 12 孔儲液槽、1個NEST 0.1mL PCR板及1個 NEST  2mL 深孔板利用好，模組包括一個磁珠純化模組和一個溫控模組深入各系統，配備一個 P300 多通道移液器。所有的 NEST 耗材和模組都由 Opentrons 提供系列。

圖2:在OT-2平臺上使用RNAdvance Viral試劑盒的吞吐量狀況整個工作流程運(yùn)作所需的時間包含3個部分：操作時間作用、裂解時間和運(yùn)行時間。操作時間包括樣品和OT-2的準(zhǔn)備工作慢體驗。運(yùn)行時間指的是 OT-2從開始到完成整個協(xié)議所需的時間著力增加。 A)處理8個樣本需要45分鐘，處理96個樣本需要2小時38分了解情況。 B) 圖形化顯示了不同樣品數(shù)量下的運(yùn)轉(zhuǎn)處理時間深入。

RNAdvance 病毒試劑盒檢測限制檢測限制(LoD)是用於確定OT-2平臺上自動化RNAdvance Viral萃取效率的指標(biāo)，它表示能夠在≥95%的重複測量中檢測到的病毒拷貝數(shù) 的最低濃度重要的。我們使用2019-nCoV CDC N1和RP引子和探針(2019-nCoV CDC EUA kit,Integrated DNA Technologies (IDT)) 進(jìn)行偵測開展研究，PCR 混合液和酵素使用Luna°通用探針一步RT-q England BioLabs),PCR反應(yīng)在PCRmax ECO48即時PCR 系統(tǒng)上進(jìn)行。在SARS-CoV-2 樣本 (n=20) 和陽性對照樣本 (n=2) 中檢測到病毒RNA (拷貝數(shù)/μL), 但在陰性對照樣本 (n=2) 中未檢測到相互融合。根據(jù)表1的總結(jié)質生產力，分析範(fàn)圍內(nèi)的所有對比陽性樣本均被確定為陽性，其中最低濃度的病毒RNA 拷貝數(shù)為1拷貝/μL技術交流。 PCR 參數(shù)如下先進的解決方案。

表1:使用OT-2 平臺和 RNAdvance Viral 試劑盒檢測 SARS-CoV-2 目標(biāo) N1 的病毒靈敏度。 1 copy/μL 是能夠偵測到≥95%樣本的最低濃度創造更多，被定義為偵測限制 (Limit of Detection,LoD)

為了研究 RNAdvance Viral在 OT-2 上的自動化性能宣講活動，我們將850 copy/μL 濃度的熱滅活 SARS-CoV-2 病毒加入合成鼻腔基質(zhì)中，並萃取RNA工藝技術。 針對N1和RP, 確定了均值Ct值效率、標(biāo)準(zhǔn)差、變異係數(shù) (CV%) 和檢測率等規(guī)格參數(shù)(圖3A)近年來。在實(shí)驗(yàn)樣本(n=20)講道理、 陽性對照樣本(n=2) 和陰性對照樣本(n=2) 中，對N1 的擴(kuò)增曲線進(jìn)行定量分析(圖3B), 同時對包括對照樣本在內(nèi)的樣品中的RP進(jìn)行定量分析(圖3C)。

DNA 定序與數(shù)據(jù)分析為了進(jìn)一步了解定序性能更多的合作機會，我們使用Swift 2S Turbo DNA文庫製備試劑盒和 Swift Unique Dual Indexing 引子板進(jìn)行 N1擴(kuò)增延伸。關(guān)於850 copy/μl 樣本的詳細(xì)資料和序列比對結(jié)果可以在圖4 中找到。我們觀察到平均覆蓋率為 455x, 且平均讀數(shù)有91%與參考基因組 SARS-CoV-2 分離自Wuhan-Hu-1(NC_045512.2) 對齊服務好。讀取長度與 N1擴(kuò)增區(qū)域相匹配新趨勢，大約為72個鹼基。根據(jù)Swift 2s Turbo DNA 文庫製備試劑盒製造商的說明共謀發展，預(yù)期插入片段大小約為 200bp學習。 定序是使用 lllumina MiSeq 進(jìn)行的，並將篩選資料上傳至llluminaBaseSpace聽得懂。在 Galaxy 中使用 Bowtie2 確定了覆蓋度應用優勢，並使用 Integrative Genome Viewer(IGV) 進(jìn)行視覺化。 NC_045512.2,SAR2-COV-2, 分離源自Wuhan-Hu-1 的基因組是用於定序的NCBI參考基因組全方位。透過在 Galaxy 中使用QualiMap-BAMQC 工具全面展示，分析了調(diào)準(zhǔn)、讀長新技術、片段大小和CG含量等資訊。

A) 綜合數(shù)據(jù)QC 表描述了多個數(shù)據(jù)點(diǎn)順滑地配合，包括455-x 的平均覆蓋率和與參考基因組對齊的平均讀數(shù)深入，SARS-CoV-2 分離株Wuhan-Hu-1 (NC_045512.2) 為91% 。根據(jù) Swift 2s Turbo DNA Library Prep 製造商的預(yù)期插入片段大小約為200bp前沿技術。 B)每個樣本與參考基因組對齊的比較基礎。

總結(jié)本研究透過 Beckman Coulter Life Sciences RNAdvance Viral 試劑盒和 Opentrons OT-2 提供了一個穩(wěn)定、高性價比的自動化萃取方 案多種方式。此工作流程經(jīng)過優(yōu)化對外開放，用於SARS-CoV-2 病毒 RNAPCR 檢測，在LoD (檢測限制)為每微升1個拷貝時進(jìn)行了測量深入交流研討。我們使用了高 通量定序 (NGS) 進(jìn)行測試資料，在平均樣本覆蓋度達(dá)到455 X 和平均讀取對齊到 SARS-CoV-2 參考基因組的91%。該研究表明關註度，利用 RNAdvance Viral 試劑和 Opentrons OT-2 進(jìn)行樣本萃取可以實(shí)現(xiàn)高效且經(jīng)濟(jì)的 SARS-CoV-2 病毒 RNA 萃取橫向協同。同時，在定序分析方面敢於挑戰， 此方案具有高平均覆蓋率和較高的對齊率不斷創新，能夠?yàn)檠芯咳藛T提供具有重要意義的遺傳資訊。這對於致力於研究SARS-CoV-2 病毒的臨床研究人員來說提供了遵循，為他們的工作提供了一個高效參與水平、可行的樣本準(zhǔn)備方案。