作者Boren Lin,PhD,Kinnari Watson,PhD

應用概述酵素免疫分析 (EIA) 或酵素連結免疫吸附測定 (ELISA) 是液體樣本中檢測目標分子(例如抗原)的常用分析工具無障礙，通常用於免疫診斷 或研究向好態勢。本測定一般採用96 孔板格式持續發展，且工作流程通常包括 試劑轉移和混合，以及一些在恆定溫度下的孵育和洗滌步驟要落實好。這 些步驟均要求樣本處理高度一致性。為了實現(xiàn)自動化供給，我們使用OT-2 自動化移液工作站搭配熱振盪儀研發(fā)並測試了ELISA 全自動化的方案我有所應，該方案使用Takara Bio 公司的夾心法EIA 試劑盒檢測人類纖連蛋白(FN),Tecan 的競爭法ELISA 試劑盒檢測唾液中的皮質(zhì)醇過程中，以及Cell Sciences 的另一種競爭法ELISA 試劑盒用於定量血清樣本中的中和SARS-CoV-2抗體去突破。

關鍵發(fā)現(xiàn)配備8通道移液管和熱振盪儀的 OT-2 移液工作站具備高精度自動化完成 ELISA的能力。在更高的吞吐量設定中達到，該協(xié)定可以用最少的操作時間處理多達96個樣本智能設備。

應用介紹酵素免疫分析 (EIAs) 或酵素連結免疫吸附測定 (ELISAs) 是一種透過 高度特異的抗體-抗原的相互作用對液體樣本的目標分子(例如 抗原)進行檢測和定量的技術。這種測定通常在96孔或384孔 板上進行蓬勃發展，我們把抗原固定在孔板上特點，可以透過直接將抗原連接 到固體表面或使用預塗在固體表面的捕獲抗體來實現(xiàn)。透過這個過程重要性，它能夠將抗原與樣本中其他非標靶分子分開又進了一步。

夾心法 ELISA是此測定方法中最常用的形式。常規(guī)步驟如下：1多元化服務體系、如果供應商未提供預塗該抗體的孔板貢獻力量，我們則需要將捕獲抗體(即與目標物特異結合的抗體)通過被動吸附的方式固定在孔板上(例如，8孔或12孔條紋組裝在與96孔微孔板讀取器相容的框架上)大幅拓展。 2.將待分析的樣本加入塗有抗體的板上，使目標抗原被捕獲更加堅強。 3.將固定的目標抗原暴露給與酵素(例如辣根過氧化物酶或HRP)偶聯(lián)的檢測抗體與時俱進。 4.加入酵素的底物，以產(chǎn)生可以測量和定量的訊號。

人類纖維連接蛋白(FN)EIA試劑盒 (Takara Bio,美國加利福尼 亞州聖荷西)是一種體外定量測定血清綜合運用、尿液供給、細胞培養(yǎng)上清液 和其他生物液中可溶性人源 FN 的試劑盒。該試劑盒提供了足夠的試劑和材料實事求是，可用於在 OT-2 平臺上進行 EIA協(xié)議的設計和驗證進行探討。

FN 廣泛分佈在細胞表面、細胞外基質(zhì)和血漿中責任製，參與細胞基質(zhì)黏 附十分落實、細胞遷移、細胞形態(tài)的調(diào)控等細胞功能規則製定。 Takara 公司 的 FN EIA試劑盒採用兩種抗人源 FN 的鼠單株抗體製造業，形成抗體- 抗原-抗體夾心複合物：捕獲抗體預塗在含8連管，檢測抗體與過 氧化物酶結合關規定。透過將此複合物暴露於過氧化物酶的底物中發展基礎，可 以產(chǎn)生光度訊號，其吸光度與樣本中目標物(即人源 FN) 的數(shù)量成正比建強保護。

競爭法 ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay) 通 過 檢測訊號幹擾來測量抗原的濃度同期。簡而言之，目標抗原與預先塗在 孔板上的參照物(抗原)競爭與酵素偶聯(lián)抗體結合使命責任。樣本中目標抗 原的濃度越高效果，參考抗原與抗體結合的能力就越弱，產(chǎn)生的訊號 就越弱強化意識。 一些競爭法 ELISA 試劑盒長期間，如次本研究中測試的 Tecan 公司的 Cortisol Saliva ELISA, 酶不是由抗體攜帶，而是由參照 物攜帶現場，參照物與目標抗原競爭與抗原-抗體作用高端化。我們在OT-2 上進行測試另一個的ELISA 試劑是Cell Sciences 公司(美國馬薩諸塞州紐伯里港)的SARS-CoV-2 替代病毒中和檢測試劑盒， 用於測量SARS-CoV-2 感染後或對疫苗接種產(chǎn)生的循環(huán)中和抗體我有所應。中和抗體透過阻斷盤狀病毒融合蛋白的受體結合域(recep-tor-binding domain,RBD) 與血管緊張素轉換酶2 (angioten-sin converting enzyme 2,ACE2) 結合提單產，抑制SARS-CoV- 2 進入細胞。該試劑盒提供預先塗抹的病毒棘蛋白RBD板至關重要，以競爭法ELISA 的形式發展空間，引入HRP- 偶聯(lián)的ACE2 與中和抗體競爭捕獲RBD。

雖然 ELISA 的設計方法有很多有所應，但萬變不離其宗足了準備，他們都遵循相似的工作流程。 ELISA 的常規(guī)操作步驟包括試劑移液著力提升、孵育以及反覆洗滌深刻內涵，這些步驟可以在 OT-2 上輕鬆完成傳遞。在每個試劑步驟之間會進行連續(xù)的洗滌，以去除未結合的分子深入闡釋。為了防止剩餘的溶液帶到下一個試劑步驟中規模最大，把過量的液體全部吸走非常重要。 Opentrons的8通道移液管可進行高效統籌、精準的移液處理最深厚的底氣，以滿足 ELISA 中試劑移液和洗滌的需求。此外振奮起來，可以透過添加 Opentrons 溫控模組或熱振盪儀品質，以提升自動化功能和滿足實驗中的樣品孵育環(huán)節(jié)(例如設定為37℃以促進抗原-抗體相互作用)所需的恆溫功能。

材料與方法圖1-3顯示了在 Opentrons OT-2 上測試的三種 ELISA 的示意圖等地，包括試驗步驟概述和甲板佈局最為顯著。

液體轉移是透過8通道移液器進行的。 ELISA 孔板使用了一個帶有 有裂縫密封的封膜 (BioChromato, 日本藤澤),這樣移液器 的吸頭可以穿過封膜規定，同時在孵育期間防止蒸發(fā)環境。然後，ELISA 板被固定在熱振盪儀上高質量，並按照說明書的要求提供熱力和攪拌 作用(參考表1)相對簡便。在完成實驗後，需要立即手動將 ELISA 孔板移至酶標儀流程，並在450 nm 波長處測量吸光度值合作。

為了測試 FN EIA 試劑盒，首先將人類血漿中的 FN 溶解在去離子水中助力各業，製備出1 mg/mL 的儲備溶液極致用戶體驗，然後進一步稀釋至500 ng/mL 並進行2倍的連續(xù)稀釋。而對於皮質(zhì)醇 ELISA 測試應用，則 使用試劑盒提供的已知皮質(zhì)醇濃度的標準品和控制液建議。先前已 經(jīng)測試 SARS-CoV-2 抗體陽性或陰性的血清樣本將用於病 毒中和 ELISA 實驗。每個實驗在不同樣本量下的運行時間是可預估的(參考表1)相貫通。

實驗結果將 FN EIAs 在 OT-2 上處理不斷發展。可以透過評估最終讀數(shù)與目標分子濃度之間的相關性以及不同實驗之間這種相關性的一致性來評估樣本處理品質(zhì)自動化方案。透過繪製平均吸光度 (n=3)與 FN 濃度之間的關係圖緊密協作，並計算標準偏差，可以確定線性迴歸的擬合優(yōu)度線上線下。

結果展現(xiàn)了 OT-2 在執(zhí)行該試劑盒的實驗中的準確性和精密度(R平方>0.99,CV<10%) (圖4A), 和重複性(圖4B)發揮重要作用。使用皮質(zhì)醇的連續(xù)稀釋來測試OT-2上的競爭法 ELISA 。結果顯示液體處理的一致性(n=3,CV<10%),在半對數(shù)圖上呈現(xiàn)了試驗讀數(shù)與對數(shù)轉換後的樣品濃度之間的優(yōu)秀負線性關聯(lián)(R 平方>0 .99 ) ( 圖5A), 且實驗之間具有可重複性(圖5C)數據顯示。

為了檢測競爭法 ELISA 中 ACE2-RBD 結合的抑製作用非常完善，血清樣本 在 OT-2 上進行了三次處理性能穩定，在酶標儀上測量吸光度，並獲得了變異係數(shù)作用。結果再次確認了 OT-2 液體處理的精確性 (CV<10%)(圖6)。根據(jù)廠商的說明書行業分類，實驗是有效的技術特點，因為每個控制組 的 OD450 值都在標準範圍內(nèi)(陽性對照<0.3,陰性對照>0.9)。抑制率的計算公式如下：

本實驗成功檢測到先前被診斷為SARS-CoV-2抗體陽性的樣本中能夠中和 ACE2-RBD 交互作用的抗體(表格1)。

實驗總結透過使用OT-2 進行競爭性ELISA和中和抗體檢測便利性，我們得出結論：1全面展示、在OT-2 上進行的稀釋處理和吸光度測量顯示了高度一致的結果，證實了OT-2 液體處理的精確性和可重複性深刻認識。 2.根據(jù)廠商說明書的要求核心技術，實驗的控制組的 OD450 值都在有效範圍內(nèi)，驗證了實驗的有效性主動性。 3.利用實驗測量的抑制率創造性，成功檢測到先前被診斷為SARS-CoV-2 抗體陽性的樣本中存在的中和抗體。 4.表格2的人體血清樣本確認為陽性道路，進一步證實了其先前 ELISA檢測的結果規模設備。綜上所述，該實驗在檢測中和抗體方面表現(xiàn)出優(yōu)越的精確性和可靠性 指導，OT-2 的樣品處理能力足以與傳統(tǒng)手動方法相媲美競爭力。