應(yīng)用概述隨著不斷進(jìn)步的技術(shù)推動(dòng)至關重要，現(xiàn)代分子生物學(xué)持續(xù)取得萬眾矚目的 突破和發(fā)展尤為突出，包括更大規(guī)模的研究、更強(qiáng)大的治療方法以及全新 的研究問題優勢領先。然而性能穩定，儘管核酸萃取這項(xiàng)技術(shù)是分子生物學(xué)得以進(jìn) 步的一項(xiàng)重要且密不可分的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，科研人員仍在沿用著幾 十年前冗長而繁瑣的程序進(jìn)行核酸提取。在這樣的困局之下新體系，自 動(dòng)化解決方案應(yīng)運(yùn)而生【C合運用，F(xiàn)代自動(dòng)化透過引入具備穩(wěn)定性和高效 運(yùn)作優(yōu)勢(shì)的機(jī)器設(shè)備完成標(biāo)準(zhǔn)化流程高效自動(dòng)運(yùn)行供給，自動(dòng)化核酸 萃取將使生物實(shí)驗(yàn)室舊有的工作方式迎來現(xiàn)代化。為了真正意義 上幫助科研人員達(dá)到高效研發(fā)或生產(chǎn)的目的實事求是，自動(dòng)化系統(tǒng)需要達(dá) 到甚至超越高技能技術(shù)人員的表現(xiàn)重要的意義，為下游工作流程提供高品質(zhì)的樣本。

本研究旨在測試Opentrons OT-2核酸工作站作為有效自動(dòng)化 磁珠基因萃取工具的性能等多個領域。研究中使用了幾種研究人員和臨床醫(yī) 生常用的常見模板：人類唾液再獲、人類口腔拭子、細(xì)菌培養(yǎng)和 RNA 病毒應用擴展。同時(shí)體驗區，使用了業(yè)界常見的主流試劑品牌。透過產(chǎn) 量活動上、CV 值和qPCR 數(shù)據(jù)進(jìn)行效能評(píng)估有望，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)將與高技能技術(shù)人員的手動(dòng)操作結(jié)果進(jìn)行比較。

經(jīng)過研究測試導向作用，OT-2 表現(xiàn)優(yōu)異方案。使用OT-2 進(jìn)行提取的實(shí)驗(yàn)變異 性降低，同時(shí)復(fù)現(xiàn)率提高十大行動，並且能在較低的成本和更快的周轉(zhuǎn)時(shí) 間下提供了類似的產(chǎn)量左右。重要的是，這些效能改進(jìn)和成本節(jié)省可 以隨著吞吐量的增加而提升綜合措施。因此可靠保障，該測試表明，使用 OT-2 進(jìn) 行核酸萃取自動(dòng)化可以使實(shí)驗(yàn)流程高效自動(dòng)化設計標準，讓自動(dòng)化核酸萃取能夠滿足高端分子生物學(xué)的高性能標(biāo)準(zhǔn)開展。

研究材料與方法人類唾液： 從匿名捐贈(zèng)者收集新鮮唾液並儲(chǔ)存在15 mL 錐形管中直至使用。

口腔拭子：使用20 mm break point (Zymo@) 口腔採集拭子對(duì)匿名 志願(yuàn)者進(jìn)行採樣發揮重要帶動作用，並儲(chǔ)存於在1 mL Zymo DNA/RNA 保護(hù)液中意向，室溫保存運(yùn)輸，

細(xì)菌培養(yǎng)： 使用 One shot°TOP10 製備感受態(tài)大腸桿菌 (Thermo Fisher Scientific*) 在37°℃,225 rpm 振盪條件下在溶菌液中培養(yǎng)過 夜至關重要。使用前發展空間，每個(gè)樣品以2000 rpm 離心1.5 分鐘。移除上清液無障礙，沉澱物被重新懸浮於等體積的冷磷酸鹽緩衝液中連日來。此外，對(duì)於乳酸桿菌樣品，每個(gè)樣品使用約1×107拷貝/μL的 Lactobacillus plantarum(ATCC°8014MINIPACKTM)系統。

病毒：由於2020年3月COVID-19 全球大流行開始(1),病毒 RNA 試劑盒中使用了的合成 SARS-COV-2 RNA Control 2(Twist Biosci- ences), 每個(gè)樣品10拷貝/μL增強。

內(nèi)部對(duì)照：依照 Panpradist、Nuttada 等人(2)中所述使用和創(chuàng)建合 成鼻樣基質(zhì)(SNM)交流等。 SNM 的配方為：110 mM NaCl更加廣闊、1%w/v來自豬胃類型I的黏蛋白(Sigma M2378-100G)和10 μg/mL w/v 人類基因組DNA(Coriell NA12878), 混合體積為TE/SNM的90%。每個(gè)病毒樣本使用50 pg/μL的 SNM提高。

試劑盒：本研究中選擇了來自不同品牌的 DNA可以使用、RNA 和病毒 RNA萃取試劑盒(參見表1)〖檶?？偣矙z驗(yàn)了7個(gè)試劑品牌的13種試劑盒效高化。

萃仍O備製造。?在自動(dòng)化檢測之前，我們對(duì)每個(gè) DNA 和 RNA 萃取試劑及 模板進(jìn)行了手動(dòng)測試攻堅克難，以取得手動(dòng)測試基線濃度管理。每個(gè)模板在每 種試劑中進(jìn)行7次重複測試，並配備1 個(gè)陰性對(duì)照樣本雙向互動。本次研 究在 Opentrons 平臺(tái)上進(jìn)行了自動(dòng)化核酸萃取效率和安。對(duì)於 DNA 和 RNA 萃取試劑，每個(gè)樣本進(jìn)行了7 次萃取新品技。對(duì)於病毒RNA 萃取試 劑盒範圍，包括了22 個(gè)具有相同的 SARS-CoV-2 和 SNM 模板的樣本 本。每個(gè) OT-2 運(yùn)行中都包括1個(gè)陰性對(duì)照樣本(nuclease-free H2O) 紮實做。 OT-2 的設(shè)備組裝了 GEN2 磁珠純化模組、p300 多通道 移液管和選購配的 GEN2 溫控模組加強宣傳，對(duì)於 RNA 實(shí)驗(yàn)來說臺上與臺下，為確保 更好的實(shí)驗(yàn)效果，建議配備溫控模組技術發展。根據(jù)不同的試劑盒集聚效應，需要 使用大約14盒300 μL 吸頭，1 個(gè) NEST 的單孔儲(chǔ)液器重要手段，1 個(gè)NEST 2 mL深孔板互動講，2個(gè) NEST12 孔儲(chǔ)液槽和1個(gè)PCR 孔板。

引子：疾病管制與預(yù)防中心(CDC)的引子和探針：

2019-nCoV_N1-F(GACCCCAAAATCAGCGAAAT)2019-nCoV_N1-R (TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG)2019-nCoV_N1-P(FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BHQ1)2019-nCoV_N2-F(TTACAAACATTGGCCGCAAA)2019-nCoV_N2- R(GCGCGACATTCCGAAGAA)2019-nCoV_N2-P(FAMACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAG-BHQ1)RP-F(AGATTTGGACCTGCGAGCG),RP-R(GAGCGGCTGTCTCCACAAGT)RP-P (FAM-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ1)

CDC 引子和探針訂購自從Integrated DNA Technologies公司，又稱IDT (2019-nCoV CDC EUA試劑盒)過程中。 N1去突破、N2 和RNase P以CDC 建議的濃度進(jìn)行預(yù)混。 16s 引子：Forward (CCTATAAGACTGGGATAACTTCGGG)Reverse (CTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCG)16s 引子從IDT 訂購達到，於IDTE 1XTE 溶液 pH:8.0(DT) 中重懸智能設備，稀釋至10uM 的工作濃度。

定量測量： DNA 和 RNA 樣本的濃度可以使用 Qubit 4.0 FluorometerM(Thermo Fisher)進(jìn)行定量測量蓬勃發展。

此外特點，所有樣本均在 PCR max ECO48 實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng)上進(jìn)行 qPCR 定 量。 RNA 樣本使用Luna°通用探針一步式 RT-qPCR 試劑盒(NEB) 進(jìn)行 測試重要性，濃度由 Lista 又進了一步、Maria Jose 等人測試(3)。 進(jìn)行以下程序：在 55℃下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄10分鐘多元化服務體系。初始變性在95℃下進(jìn)行1 分鐘規劃，然後進(jìn) 行50個(gè)循環(huán)，即在95℃下變性10秒大幅拓展，並在60℃下退火30秒發行速度。使用 Luna Universal qPCR Master Mix (NEB)以製造商建議的濃度對(duì)DNA樣 品進(jìn)行測試。使用以下程序：初始變性在95℃下進(jìn)行60秒與時俱進，隨後變性和延伸分別在95℃和60℃下進(jìn)行15秒和30秒性能，持續(xù)40個(gè)循環(huán)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果透過 qPCR 和螢光計(jì)分析測量綜合運用， OT-2 萃取的核酸數(shù)量接 近供給，核酸樣本的 一 致性更高。

OT-2 經(jīng)過了符合EUA 標(biāo) 準(zhǔn) 的性能測試實事求是，可以與多種qPCR 核提取試劑盒 一 起使用進行探討。

使用九種常用的萃取試劑盒處理人類唾液和植物乳桿菌細(xì)菌培養(yǎng) 物，並使用兩種常見的 qPCR 標(biāo)靶進(jìn)行 qPCR 分析： RNase P 用於 唾液樣本責任製，16s 用於細(xì)菌樣本十分落實。使用六個(gè)試劑盒處理大腸桿菌培養(yǎng)物並使用螢光分析進(jìn)行分析。

產(chǎn)量透過qPCR 中的循環(huán)閾值(Ct) 和螢光計(jì)中所得的ng/μL進(jìn)行評(píng)估規則製定。 一致性則透過Ct值的變異係數(shù) (CV) 進(jìn)行評(píng)估製造業。

Ct值反映了樣品跨越高於背景訊號(hào)的閾值所需的複製週期量，因此 它們傳達(dá)了數(shù)量的倒數(shù)測量關規定。對(duì)於這些目標(biāo)發展基礎，在此類樣品中，25-35的 Ct 值較為可靠建強保護。

透過所有萃取試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn)測試同期，使用OT-2自動(dòng)化系統(tǒng)進(jìn)行核酸 萃取純化可以得到具有較低CV 和可比較產(chǎn)量的Ct值(見圖1和表2)生產效率。熟練的技術(shù)人員和OT-2回報(bào)的平均Ct值為25-35。

手動(dòng)處理的CV 值為1.41-4.8, OT-2 的CV 值為1.2-2.6效果。熟練的技術(shù) 人員和OT-2提供了可比較且一致的24-26 ng/μL的產(chǎn)量使用。這些結(jié)果表明， OT-2能夠在提高一致性和重複性的同時(shí)提供高產(chǎn)量長期間。

在與新冠病毒相關(guān)的測試中高端化，使用合成的 SARS-CoV-2 樣本和七種 常用的萃取試劑盒進(jìn)行了qPCR力量。 我們使用了 SNM 中的人類基因組 DNA 作為內(nèi)部對(duì)照，使用CDC 的 SARS-CoV-2N1 和 N2 引子進(jìn)行定量分析提單產，同時(shí)使用 CDC 的 RP 引子作為陽性對(duì)照深入實施。

這項(xiàng)測試旨在評(píng)估使用不同萃取試劑盒在 OT-2 上進(jìn)行新冠病毒 qPCR 分析的性能。透過使用合成的 SARS-CoV-2 樣本以及內(nèi)部對(duì) 照和陽性對(duì)照發展空間，可以判斷 OT-2 在檢測病毒基因組的準(zhǔn)確性和可靠性效果。

qPCR 性能的評(píng)估是基於 PCR 檢測緊急使用授權(quán) (EUA) 標(biāo)準(zhǔn)。 為了滿足 EUA 標(biāo)準(zhǔn)足了準備， 一個(gè)測試必須達(dá)到95%的擴(kuò)增效果合作關系，也就是說，在qPCR 中深刻內涵，95%的樣本必須產(chǎn)生可偵測的N1和N2訊號(hào)傳遞。

在這種性能評(píng)估中，我們也對(duì) qPCR Ct 值進(jìn)行了評(píng)估貢獻。對(duì)於這些目標(biāo)規模最大，在這類樣本中，標(biāo)準(zhǔn) Ct值應(yīng)該在30-40之間統籌。

根據(jù)表格 3 的結(jié)果最深厚的底氣，OT-2 幾乎在所有試劑盒上的表現(xiàn)都通過了 EUA 標(biāo)準(zhǔn)。除了兩個(gè)由於裂解緩衝液過度黏稠導(dǎo)致妨礙了萃取過程 的試劑盒只有91%的測試結(jié)果合格振奮起來。並且品質，在所有被測試的試劑中， 樣本結(jié)果均達(dá)到了31-39的標(biāo)準(zhǔn) Ct 值深入各系統。這些結(jié)果表明最為顯著，OT-2 系統(tǒng)可以與各種品牌的試劑配對(duì)使用，並達(dá)到臨床標(biāo)準(zhǔn)規定。

為了測試OT-2 系統(tǒng)的吞吐量和速度，我們使用了13種熱門試劑盒 進(jìn)行了RNA 和DNA 萃取空間載體，並覆蓋了不同長度高質量。為了全面評(píng)估不同吞 吐量下的速度，測試了每批8、24流程、48和96個(gè)樣本的情況合作。以從原始樣本到純化核酸所需的時(shí)間來衡量實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

在這些萃取試劑方案中助力各業，OT-2 系統(tǒng)在各種試劑盒和長度下實(shí)現(xiàn)了 快速萃取的結(jié)果極致用戶體驗。在最短的協(xié)議中，處理8 個(gè)樣本只需要25 分 鐘應用，在最長的協(xié)議中建議，處理96個(gè)樣本不到5小時(shí)(圖2)。對(duì)於8 個(gè)樣本的處理時(shí)長相貫通， OT-2 在13種試劑盒中平均處理時(shí)間為52分 鐘不斷發展。而在96個(gè)樣本的情況下， OT-2 在13種試劑盒中平均處理時(shí)間 為2小時(shí)45分鐘自動化方案。這些結(jié)果表明緊密協作， OT-2系統(tǒng)可以將其高效能與高吞吐量結(jié)合，顯著改善提取工作流程線上線下。

研究思考OT-2 核酸萃取工作站從有機(jī)和合成原始模板中提供了優(yōu)質(zhì)的 RNA 和 DNA 樣本。透過 qPCR 和螢光測試發(fā)現(xiàn)聽得進，此自動(dòng)化系統(tǒng)產(chǎn)生的 產(chǎn)出與由高技術(shù)水平操作人員執(zhí)行的手動(dòng)結(jié)果相當(dāng)新的力量，並且在實(shí)驗(yàn)復(fù) 現(xiàn)率和精確性方面超過了手動(dòng)操作的性能。研究表明便利性，OT-2 成功 地達(dá)到了滿足緊急使用授權(quán) (EUA) 標(biāo)準(zhǔn)級(jí)別性能的要求全面展示， qPCR 信號(hào)檢測的成功率超過了95%。時(shí)間測試顯示深刻認識，OT-2 處理8個(gè)樣 品的時(shí)間不到1小時(shí)核心技術，對(duì)於96個(gè)樣品的處理時(shí)間不到3 小時(shí)應用提升，這是針對(duì)具有不同協(xié)議長度的試劑盒的平均值。事實(shí)上創造性，使用最快的 試劑盒發展的關鍵，OT-2 處理8個(gè)樣本只需要25分鐘，處理96個(gè)樣本只需1個(gè)半小時(shí)規模設備。

應(yīng)用總結(jié)●對(duì)於中等通量的實(shí)驗(yàn)室來說真諦所在，光是節(jié)省的時(shí)間就足以讓OT-2在不到6個(gè)月的時(shí)間內(nèi)回本。

●OT-2每次處理24個(gè)樣品的萃取可節(jié)省3.5小時(shí)的人工操作時(shí)間競爭力。與手動(dòng)操作相比充分，更高的吞吐量帶來更好的精確性、減少的變異性和提高的可重複性製造業。

●這種高性能可以促進(jìn)更好的品質(zhì)控制優化服務策略，減少下游資料的變異 性。此外發展基礎，消除了繁瑣的人工操作程序可以減少錯(cuò)誤兩個角度入手，並降低因?yàn)槭褂冒嘿F試劑重複運(yùn)行程序而產(chǎn)生的成本。

這些測試都是在具有臨床和實(shí)驗(yàn)室意義的多個(gè)樣本以及各種不同的萃取試劑盒中進(jìn)行的積極。 OT-2 的靈活性使其能夠適應(yīng)各種協(xié)議探索、試劑和樣本類型，以持續(xù)提供優(yōu)質(zhì)的結(jié)果產業。