分子克隆是合成生物學(xué)的核心，因為它包括 DNA 的組裝及其在目標(biāo)宿主中的表現(xiàn)規模設備。然而，目前克隆通常是一個手動、耗時且重複的過程，自動化將極大地促進此過程的發(fā)展雙重提升。完整的合理克隆過程（即從 DNA 創(chuàng)建到在靶宿主中表達）的自動化涉及不同操作和機器的整合發展契機。這類工作流程的範(fàn)例很少，尤其是當(dāng)設(shè)計合理（即DNA 序列設(shè)計是固定的信息化，而不是基於隨機庫）且目標(biāo)宿主在遺傳上不太易於處理（例如，對熱休克轉(zhuǎn)化不敏感）時生動。在本研究中新型儲能，介紹了一種自動化工作流程，用於合理構(gòu)建質(zhì)粒並將其隨後接合轉(zhuǎn)移到生物技術(shù)平臺生物谷氨酸棒狀桿菌中新品技。整個工作流程都配有客製化的軟體工具範圍。作為應(yīng)用範(fàn)例，建構(gòu)並表徵了基於調(diào)節(jié)器 Lrp 的合理設(shè)計的轉(zhuǎn)錄因子生物感測器庫紮實做。獲得了具有改進的動態(tài)範(fàn)圍的傳感器空間廣闊，並且從篩選中獲得的見解為谷氨酸棒桿菌Lrp的雙重調(diào)節(jié)功能提供了證據(jù)。

介紹大宗和精細(xì)化學(xué)品的微生物生產(chǎn)是實現(xiàn)更永續(xù)的全球經(jīng)濟的重要組成部分。為了促進這一發(fā)展雙重提升，必須提高對微生物生命的基本理解及其工程設(shè)計以滿足社會需求。近年來事關全面，人們提出了採用設(shè)計-建構(gòu)-測試-學(xué)習(xí) (DBTL) 循環(huán)作為實現(xiàn)這一目標(biāo)的工具表現明顯更佳。 （1）分子克隆在這一循環(huán)中發(fā)揮重要作用，因為它可以產(chǎn)生具有不同特性的新基因型以供探索技術節能。目前已開發(fā)出多種軟體工具來幫助進行基因型的電子克隆指導，其數(shù)量很容易超過實驗室中手動克隆的數(shù)量。 （2）現(xiàn)在國際要求，在短時間內(nèi)設(shè)計數(shù)百種基因型已成為可能流動性。例如，一條由 5 個基因組成的生產(chǎn)途徑競爭激烈，每個基因具有 3 個不同的核醣體結(jié)合位點 (RBS)持續創新，已經(jīng)產(chǎn)生了 3 5 = 243 種變體。然而，這種項目的設(shè)計相對簡單協調機製，現(xiàn)在瓶頸轉(zhuǎn)移到實際體外創(chuàng)建這些序列及其在所需工業(yè)宿主中的表現(xiàn)信息化。 （3）可以透過使用一鍋組裝和篩選方法來解決該問題，即獲得許多但不一定是全部的變體向好態勢，並使用篩選試驗來選擇表現(xiàn)最佳的變體平臺建設。 （4）然而，這些方法有一個缺點：知識僅來自成功建造並從一鍋反應(yīng)中分離的少數(shù)變體貢獻力量。較難建構(gòu)的變體在這種反應(yīng)中較少使用，因此不太可能篩選出它們的特性。對於許多基本的生物學(xué)問題發行速度，這不是一個理想的解決方案更加堅強。在這裡，合理的菌株構(gòu)建和工作流程所有步驟內(nèi)所有品種的完整可追溯性是必要的性能，就像經(jīng)典分子克隆所實現(xiàn)的那樣不斷豐富。然而，目前分子克隆通常是一個手動組建、耗時且重複的過程，自動化將為其帶來巨大好處效果較好。 （5）合理克隆工作流程的自動化具有多種好處重要的意義。實驗人員在菌株構(gòu)建上花費的動手時間可以大大減少。再加上可以實現(xiàn)更高的吞吐量等多個領域，這大大增加了可以及時生產(chǎn)的構(gòu)建體的數(shù)量再獲。此外，自動化透過消除過程中的隨機變化引入了流程的標(biāo)準(zhǔn)化應用擴展。這些過程也可以更容易監(jiān)控和分析體驗區，從而更容易找到改進的空間。因此活動上，自動化可以提高克隆工作流程的數(shù)量和品質(zhì)有望。近年來，微流體技術(shù)已用於實現(xiàn)克隆過程的自動化導向作用。 （6,7）在這裡方案，客製化的微流控晶片用於為單一單元操作提供液體分離和液體轉(zhuǎn)移。雖然這種技術(shù)具有將許多單元操作組合在一個設(shè)備中的優(yōu)勢十大行動，並且能夠擴展到每個晶片進行大量實驗左右，但需要高度專業(yè)的基礎(chǔ)設(shè)施和人員來製造晶片並進行實驗。更模組化綜合措施、更方便的解決方案是使用標(biāo)準(zhǔn)液體處理系統(tǒng)可靠保障，如果需要，也可以使用輔助設(shè)備。這樣的系統(tǒng)可能相當(dāng)複雜高端化，能夠執(zhí)行大量具有不同任務(wù)的實驗力量，（8?11）而且還有更具成本效益的解決方案可供選擇。 （12）最近提出的策略利用特定細(xì)菌的自然轉(zhuǎn)化能力用上了，從而產(chǎn)生一種高效且易於使用的克隆方法提升行動。 （13）然而，這種方法僅限於少數(shù)主動吸收外源 DNA 的生物關註。迄今為止發(fā)布的大多數(shù)自動克隆工作流程都集中於大腸桿菌研究進展。 （14）大腸桿菌是一種成熟的分子克隆宿主，在遺傳學(xué)上非常容易操控連日來。許多遺傳工具已被開發(fā)和優(yōu)化用於大腸桿菌快速融入，並且有全面的組學(xué)數(shù)據(jù)可用。然而系統，由於大腸桿菌的低壓力耐受性和噬菌體感染風(fēng)險增強，它並不總是工業(yè)過程的理想宿主。 （15）因此交流等，擴展自動化平臺以涵蓋對其他遺傳上較難處理的微生物進行工程改造將是有益的更加廣闊。谷氨酸棒狀桿菌是一種廣泛使用的工業(yè)細(xì)菌（16）由於其對熱休克轉(zhuǎn)化等自動化友好轉(zhuǎn)化過程具有抵抗力，因此其改造難度比大腸桿菌更大提高。雖然已經(jīng)朝這個方向採取了一些措施可以使用，（17）它們通常無法實現(xiàn)實際目標(biāo)生物轉(zhuǎn)化過程的自動化，最常見的原因是紮實，電穿孔（針對此類生物的首選方法）不易實現(xiàn)自動化效高化。本研究提出了一個完整的工作流程，用於自動化合理地建構(gòu)抗熱休克微生物菌株投入力度。所有工作均使用標(biāo)準(zhǔn)液體處理系統(tǒng)進行創造。 PCR 和 Gibson 組裝用於建立 96 個質(zhì)粒的文庫。開發(fā)了大腸桿菌熱休克轉(zhuǎn)化的自動化方案作為穿梭系統(tǒng)貢獻法治。菌落 PCR 和定序用作品質(zhì)控制設備製造。對於轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌的最後一步，開發(fā)了一種新穎的高通量接合工作流程攻堅克難。接合是一種描述良好且高度相關(guān)的細(xì)菌轉(zhuǎn)化技術(shù)信息化。 （18）這種方法效率很高，但由於需要使用瓊脂板和濾紙生動，因此通常比較費力新型儲能。在本研究中，我們透過使用離心法簡化了操作並使其自動化上高質量。整個工作流程都配有一個客製化的軟體工具一站式服務，用於追蹤所有構(gòu)建體及其在流程中的狀態(tài)廣度和深度。作為應(yīng)用範(fàn)例，顯示了谷氨酸棒桿菌中不同 Lrp 生物感測器變體的組裝和表達引領作用。 Lrp 生物感測器先前已開發(fā)用於檢測谷氨酸棒桿菌中的l -蛋氨酸和支鏈氨基酸加強宣傳。 (19)此感測器將細(xì)胞內(nèi)l -蛋胺酸和支鏈胺基酸濃度與eyfp的表達結(jié)合，後者編碼一種螢光報告蛋白用的舒心。細(xì)胞內(nèi)濃度增加會導(dǎo)致螢光訊號增強技術發展。一般而言，生物感測器的設(shè)計相對模組化集成；可以透過修改核醣體結(jié)合位點和啟動子長度等來改變其特性重要手段。 （20,21）此外，透過設(shè)計穩定性，它們提供了基因型和表型之間的直接且易於測量的關(guān)係像一棵樹；即Lrp 感測器設(shè)計的變化可能會導(dǎo)致不同的可測量螢光輸出。因此去突破，選擇不同 Lrp 生物感測器的合理設(shè)計作為應(yīng)用範(fàn)例能運用，以展示我們的克隆自動化方法的優(yōu)勢。

結(jié)果與討論自動化基因工程工作流程本研究開發(fā)的自動克隆工作流程（圖1）可分為兩個階段：質(zhì)粒在大腸桿菌中的組裝和擴增以及將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到目標(biāo)生物體（本例中為谷氨酸棒桿菌）中智能設備。質(zhì)粒的建構(gòu)是透過電腦設(shè)計零件不可缺少、透過 PCR 建構(gòu)片段以及透過 Gibson 組裝整合到骨架載體中。之所以選擇 Gibson 組裝特點，是因為它允許質(zhì)粒無疤痕組裝重要的角色。 (22)隨後經(jīng)由熱休克轉(zhuǎn)化為大腸桿菌。將所得克隆透過冷凍保存向好態勢，並透過菌落 PCR 進行第一步品質(zhì)控制。之所以選擇這種方法服務機製，是因為其成本效益高且運行時間短貢獻力量。此菌落PCR 的結(jié)果影響了接下來的步驟：只有菌落PCR結(jié)果為陽性的大腸桿菌克隆，即所得的DNA 片段具有預(yù)期大小大幅拓展，顯示片段成功組裝到主鏈中發行速度，才會被考慮用於自動質(zhì)粒製備，並同時結(jié)合到谷氨酸棒桿菌中與時俱進。純化的質(zhì)粒用於定序作為最終的品質(zhì)控制性能。之後，篩選自動建構(gòu)的菌株以表徵改變的特性高效。最重要的是溝通協調，每個單元操作都被設(shè)計為獨立的，因此可以在脫離工作流程時使用體系。

自動化單元操作由低成本液體處理設(shè)備 Opentrons OT-2 和基於前面描述的 Tecan EVO 200 的更複雜的液體處理平臺執(zhí)行或支援製造業。 （23,24）這兩個系統(tǒng)有著根本的不同：??OT-2 使用兩個帶有一次性吸頭的空氣置換移液器優化服務策略。可用移液器的容量範(fàn)圍與手動移液器相似發展基礎，操作員必須選擇適合實驗的移液器兩個角度入手。它沒有機械手；因此顯示，它不能改變平板的位置創新為先，例如，將平板放在加熱塊上或離心機中科普活動。平臺可容納多達九個微量滴定板創新延展。本研究使用的模型沒有配備冷卻實驗室器皿的選項。設(shè)計並 3D 列印了一個可裝滿冰和接頭適配器的定製冷卻架（請參閱支援資訊） 長期間，以便在必要時（例如基本情況，用於 Gibson 組裝）冷卻試劑。本研究中使用的配置中的 EVO 200 有一個基於液體的液體處理系統(tǒng)高端化，容量範(fàn)圍為 3 至 990 μL力量。它配備了一臺離心機、一個冷卻載體和一個加熱器/振動裝置提單產，兩者都可供整合的機器人操縱臂使用深入實施。根據(jù)所使用的載體，該平臺可容納 15 個或更多的微量滴定板發展空間。為了將細(xì)菌培養(yǎng)物點到 100 毫米圓形培養(yǎng)皿上效果，我們設(shè)計了一個客製化適配器並進行了 3D 列印（請參閱支援資訊）解決。決定使用兩種不同的液體處理系統(tǒng)是出於最高效利用實驗室設(shè)備的需求：只要有可能預期，就使用 OT-2 進行單元操作。與更昂貴的 EVO 200 相比幅度，這節(jié)省了時間結構，因此可用於要求更高的實驗。在本研究中貢獻，單元操作「菌落採摘」是手動完成的規模最大。它可以透過專用設(shè)備自動完成，但當(dāng)時沒有這些設(shè)備統籌〕尚c經驗；掇D(zhuǎn)錄因子的生物感測器的合理組合設(shè)計為了證明我們的工作流程的適用性適應性，設(shè)計、建構(gòu)並在谷氨酸棒桿菌中表達了不同版本的 Lrp 生物感測器稍有不慎。 Lrp 生物感測器將細(xì)胞內(nèi)l -蛋氨酸重要作用、l -亮氨酸、l -異亮氨酸和l -纈氨酸濃度與螢光報告蛋白 eYFP 的表達相結(jié)合最為顯著。為了建構(gòu)不同版本的 Lrp 生物感測器尤為突出，對感測器的不同部分進行了修改。 Lrp 生物感測器由lrp基因（編碼Lrp 轉(zhuǎn)錄因子）環境、發(fā)散表達的eyfp基因（編碼螢光報告基因）和基因間區(qū)（包含lrp啟動子和eyfp上游的brnF啟動子以及eyfp RBS）組成(19)（圖2 ）針對lrp起始密碼子和RBS空間載體、brnF啟動子和eyfp RBS設(shè)計了不同的變體。

對於lrp起始密碼子，選擇了三種變體：天然起始密碼子ATG（應(yīng)導(dǎo)致最高表達）極致用戶體驗、起始密碼子GTG（應(yīng)導(dǎo)致較低表達）和TGT（應(yīng)導(dǎo)致非常低或無表達） 提供有力支撐。這些起始密碼子變體中的每一個都與三種不同的lrp RBS 組合，同樣從最高表達到最低表達：GCTAAAATGG（最強）建議、GCTATTGTGC（天然品率，較弱）和 CAATCCTACC（最弱）。 lrp側(cè)的三個起始密碼子和三個 RBS 的組合產(chǎn)生了 3 × 3 = 9 種不同的引子不斷發展。 eyfp基因在brnF啟動子的控制下表達積極影響，該啟動子含有 Lrp 蛋白的結(jié)合位點。 (25)因此不斷進步，當(dāng)啟動子序列縮短或延長時工藝技術，可以添加或移除結(jié)合位點。由於brnF轉(zhuǎn)錄為無前導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本更加廣闊，且brnF的第一部分可能具有調(diào)控功能，(26)標(biāo)準(zhǔn)Lrp感測器的eyfp啟動子包含brnF的前30bp 講故事。本研究設(shè)計了四種不同的變體非常完善，從+30（標(biāo)準(zhǔn)Lrp生物感測器啟動子）開始，以15為步長設(shè)計縮短版本全面革新，即+15作用、0和?15。對於eyfp的RBS行業分類，選擇了三種變體：AAAAGGAGAT（最強）技術特點、AGAAGGAGAT（天然提高鍛煉，強度較低）和ATCCGACCAT（最弱）。四種啟動子長度和eyfp側(cè)三種RBS的組合產(chǎn)生了4×3=12種不同的引子凝聚力量。這種設(shè)計策略總共包括9×12=108種不同的Lrp生物感測器變體有所提升。每種變體都可以透過單一 PCR 反應(yīng)構(gòu)建，所有 PCR 反應(yīng)都可以使用相同的 PCR 模板新的力量，即質(zhì)粒 pJC1- lrp - brnF′ - eyfp先進水平。為了組裝生物感測器質(zhì)粒，每個PCR 反應(yīng)之後都會進行雙片段Gibson 組裝全面展示，其中PCR 產(chǎn)物被組裝到pEC-Tmob18- lrp - eyfp主鏈中重要平臺；所有PCR 產(chǎn)物都經(jīng)過設(shè)計，因此它們可以組裝到相同的主鏈中核心技術。

大腸桿菌的DNA組裝與轉(zhuǎn)化在建構(gòu) Lrp 生物感測器變體之前應用提升，透過將lrp和eyfp插入可移動的 pEC-Tmob18 骨架來建構(gòu)骨架質(zhì)粒。在兩個基因之間插入一個包含兩個 NcoI 限制性位點的短間隔區(qū)創造性。此序列允許質(zhì)粒線性化發展的關鍵，並在下一步中插入包含不同lrp起始密碼子、lrp RBS保障性、brnF啟動子長度和eyfp RBS 的不同版本的序列變體帶動產業發展。 108 種變體中，96 種被選為自動克隆工作流程的應(yīng)用範(fàn)例十分落實，因為大多數(shù)自動化設(shè)備都是為 96 孔多滴定板設(shè)計的倍增效應。 PCR 變異建構(gòu)、Gibson 組裝和大腸桿菌熱休克轉(zhuǎn)化連續(xù)進行設施。 Opentrons OT-2 能夠在 85 分鐘內(nèi)自動移液 96 個 PCR 反應(yīng)需求，然後將平板手動轉(zhuǎn)移到熱循環(huán)儀中。熱循環(huán)後組合運用，使用 OT-2 混合 96 個 Gibson 組裝反應(yīng)更讓我明白了，這需要 50 分鐘。透過手動將平板轉(zhuǎn)移到熱循環(huán)儀進行孵育積極。在 50 °C 孵育步驟之前對 Gibson 主混合物進行適當(dāng)冷卻至關(guān)重要探索；否則，就無法獲得大腸桿菌轉(zhuǎn)化子產業。在我們的工作流程中滿意度，冷卻是透過將所有實驗室器皿放入裝滿冰的 3D 列印小盒子中實現(xiàn)的。大腸桿菌熱休克轉(zhuǎn)化是在 TECAN EVO200 液體處理機器人上進行的可持續，該機器人實現(xiàn)了完全無人操作的過程主要抓手，從 Gibson 組裝混合物和感受態(tài)細(xì)胞開始，到將細(xì)胞點在瓊脂板上準(zhǔn)備過夜孵育結(jié)束構建。這個過程耗時 170 分鐘創新科技》昭由?？偣苍?8 小時內(nèi)完成了 96 個構(gòu)建體的 PCR、Gibson 組裝和轉(zhuǎn)化具有重要意義，僅需 40 分鐘的手動操作時間進一步。實施熱激步驟的合適方法是將V 型底96 孔板放在加熱裝置上預(yù)熱，將8 種細(xì)胞-質(zhì)凉δ?；旌衔飶睦鋮s載體一次一個地轉(zhuǎn)移到加熱板上應用的因素之一，孵育30 秒，然後將其轉(zhuǎn)移回冷卻載體預期。雖然將整個板從冷卻載體轉(zhuǎn)移到加熱裝置更快敢於監督，但這會產(chǎn)生較不可靠的熱傳遞結(jié)果。透過離心濃縮細(xì)胞懸浮液結構，將其重新懸浮在 LB 培養(yǎng)基中重要的作用，然後點在瓊脂板上，即透過在單一瓊脂板的同一行上移取 6 個 5 μL 的點規模最大。此外穩中求進，使用大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（NEB 5-alpha 感受態(tài)大腸桿菌）和 pUC19 標(biāo)準(zhǔn)載體測試了熱休克轉(zhuǎn)化的參數(shù)。測試了熱休克溫度（37系統性、42 和 47 °C）和熱休克持續(xù)時間（0 到 30 秒勇探新路，步長為 5 秒）。令人驚訝的是傳遞，在每種條件下都成功轉(zhuǎn)化的情況下試驗，菌落形成單位幾乎沒有差異。最終開展攻關合作，選擇了與標(biāo)準(zhǔn)手動程序最相似的條件製度保障。