作者：

BO人    Lin,PhD,SHA碟     NI MRI?Sean    Arabian?kin那日     Watson,PhD i 1open TR ONS  lab works 

摘要本次應(yīng)用針對使用 BiotagePhyTip° 管柱在 Opentrons OT-2 自動 化移液工作站上進(jìn)行雙流層析的自動化進(jìn)行了應(yīng)用開發(fā)。測試了兩 種類型的 PhyTip 管柱：用於 His 標(biāo)記蛋白萃取的 Ni-IMAC 管柱和用於 人源 IgG 純化的蛋白 A 系列管柱創造性，包括蛋白 A就此掀開、ProPlus 和ProPlus LX。結(jié)果表明行動力，OT-2 和 PhyTip 柱結(jié)合使用96孔板進(jìn)行小規(guī)模蛋白樣品處理具體而言，可獲得優(yōu)異的樣品產(chǎn)量、濃度重要作用。

關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)在使用PhyTip Ni-IMAC柱進(jìn)行純化時效率和安， OT-2 能夠在保持活性 的同時對His標(biāo)記的GAPDH 蛋白進(jìn)行純化設計能力。同時，使用蛋白 A、ProPlus 和 ProPlus LX PhyTip 管柱進(jìn)行人類 IgG 純化時更為一致，OT-2 也展現(xiàn)了出色的純化能力邁出了重要的一步。使用蛋白A取得明顯成效、ProPlus 和ProPlus LX PhyTip 管柱，可在OT-2上全自動執(zhí)行多步驟純化，例如免疫沉澱參與水平。 ● 蛋白質(zhì)分析驗證了萃取蛋白為目標(biāo)蛋白導向作用，成品是符合預(yù)期的創造。 ● 在實驗設(shè)定中關註，此應(yīng)用協(xié)議可處理最多96個樣品，且僅需佔用很少的人工操作時間工具。

簡介近年來智慧與合力，由於蛋白質(zhì)表徵分析和功能測定的發(fā)展迅速，業(yè)界對蛋白 質(zhì)分析的需求與日俱增重要的角色。因此開放要求，許多可用於透過親和層析擴(kuò)大蛋白 質(zhì)分離通量的技術(shù)應(yīng)運而生，而親和層析已成為早期藥物發(fā)現(xiàn)中的重要工具平臺建設。然而服務機製，市面上適用於小規(guī)模蛋白純化的設(shè)備卻很少。並且由於研究人員缺乏程式設(shè)計和自動化專業(yè)知識使用，可能會導(dǎo)致在建立 這些流程時產(chǎn)生許多不必要的開銷大幅拓展，在優(yōu)化工作流程時，會帶來額外的成本負(fù)擔(dān)更加堅強。

PhyTip 柱是基於移液器吸頭進(jìn)行工作的色譜柱與時俱進，透過移動相(例如樣品溶液)在固定相(即填充在尖端中的樹脂)上的雙向流動來將目標(biāo)生物分子與非目標(biāo)分子分離，這個過程被稱為雙流層析不斷豐富。純 化後的樣品可以以小體積洗脫實施體系，得到高濃度的樣品組建。雙流層析 是一種溫和的純化過程各有優勢，產(chǎn)生具有高生物活性的蛋白質(zhì)。這些 PhyTip 柱利用了蛋白 A 進(jìn)行抗體的純化或富集帶動擴大。蛋白 A 是一種分 子量為49 kDa 的蛋白核心技術體系，對大多數(shù) IgG 的 Fc 區(qū)域有較高的親和力。

ProPlus (MabSelectTM SuReTm,Cytiva)和ProPlus LX (MabSelect SuRe,Cytiva) 是使用經(jīng)過改良的蛋白 A 來製備吸頭持續發展。蛋白 A 具有更強(qiáng)的結(jié)合目標(biāo) IgG 的能力必然趨勢，通常被用於抗體的純化和富集。

金屬親和層析(IMAC) 是另一種常見的方法擴大，用於從粗樣品中純 化或富集目標(biāo)蛋白多樣性。這種方法利用金屬離子提取具有基因工程標(biāo)籤 的重組蛋白，它們通常是能夠螯合金屬離子的勝肽序列。 PhyTip柱與 鎳離子(Ni)-IMAC 親和力樹脂結(jié)合明顯，透過 Ni2+ 和組胺酸鹼基之間的強(qiáng)親和力安全鏈，高效純化多組胺酸 (His) 標(biāo)記的蛋白。

OT-2 是一個對生物學(xué)家非常友善的自動化平臺創新為先。 PhyTip 柱使用與 OT-2 的單通道和8通道移液管相容的吸頭真正做到，從而實現(xiàn)了在 OT-2 上 執(zhí)行全自動蛋白純化。本研究對 PhyTip 管柱在 OT-2 上的性能表現(xiàn)進(jìn)行評估創新延展，並展示了該平臺可適應(yīng)多種應(yīng)用的能力強化意識。透過PhyTip 管柱與 OT-2 平臺結(jié)合使用，研究人員能夠?qū)崿F(xiàn)自動化運 行蛋白質(zhì)純化基本情況，提高操作的便利性和一致性現場。這為各種不同的應(yīng)用提供了更適用的解決方案，並為高通量的純化和富集提供了支持至關重要。

材料和方法在Opentrons OT-2 平臺上使用PhyTip 色譜柱進(jìn)行蛋白質(zhì)純化工作流程概述該過程的第一部分是“試劑孔板準(zhǔn)備”,用於準(zhǔn)備PhyTip 柱架和試劑孔板不久前。其中包括平衡緩衝液孔板、兩個用於不同洗滌緩衝液的孔 板以及一個洗脫緩衝液孔板提升行動。過程的第二部分是「蛋白質(zhì)純 化」,透過使用 PhyTip 柱進(jìn)行雙流層析來捕獲和富集目標(biāo)蛋白 質(zhì)能力建設。這是透過使樣品或緩衝液通過柱體內(nèi)部的樹脂(即上下移液) 而實現(xiàn)的。設(shè)定環(huán)節(jié)包括循環(huán)次數(shù)研究進展、流速和緩衝液體積無障礙，這些設(shè)定根據(jù)特定應(yīng)用進(jìn)行調(diào)整(表1)。

表1: PhyTip 管柱在 Opentrons OT-2 上測試的設(shè)定和運行時間

試劑孔板製備和蛋白質(zhì)純化方案的OT-2 平臺佈局示意圖(圖1)在本研究中測試的PhyTip 柱型號包括：● Pro A 20μL PTX-93-20-01● ProPlus 20 μL PTX-93-20-07● ProPlus LX 20 μL PTX-93-20-26● Ni-IMAC 20 μL PTX-93-20-03

蛋白質(zhì)純化流程1.取出 PhyTip 管柱2.平衡化3.捕獲目標(biāo)蛋白質(zhì)4.洗滌(第一次)5.洗滌(第二次)6.洗脫

實驗結(jié)果分離His 標(biāo)記的GAPDH, 同時保留活性通過SDS-PAGE 和蛋白定量分析快速融入，我們得出了在PBS 中提取的帶有His 標(biāo)籤的GAPDH 樣品具有理想產(chǎn)量和一致性的結(jié)論(平均產(chǎn)量為79%,變異係數(shù)為3%) (圖2上部)認為。

從細(xì)菌裂解液中分離His 標(biāo)記的GAPDH生產(chǎn)重組蛋白的常見方法是用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌OT-2 平臺上使用PhyTip 柱沒有破壞酶活性，這是透過GAPDH活性測定得出的結(jié)果(圖2中部) 增強。此外更合理，結(jié)果還表明，在兩種不同蛋白質(zhì)的樣品中均能夠成功地將 His 標(biāo)記的 GAPDH 與非目標(biāo)蛋白的BSA 分離開來(圖2下部)更優美。

原文網(wǎng)址：在OT-2上使用Biotage雙流色譜PhyTip管柱進(jìn)行自動化蛋白質(zhì)純化