作者

BO人   Lin,PhD,kin那日   Watson,PhD 1open TR ONS  lab works,Inc.

摘要本次測試研究的是在 Opentrons OT-2 自動化移液工作站上進 行基於磁珠的固定化金屬親和層析法 (IMAC) 。 我們使用PierceTM Ni-NTA 磁性瓊脂糖微珠(Thermo Fisher Scientific, USA) 測試了該方案，用於在OT-2 上提取目標蛋白(帶有His 標籤的GAPDH), 使用裂解緩衝液稀釋的重組GAPDH 蛋白運行好、HEp-2 細胞裂解液及菌細胞製備的樣本。

關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)在Opentrons 蛋白質(zhì)純化工作站上可使用 Ni-NTA 磁珠進行重組 GAPDH 蛋白純化相互配合。 ■ 實驗結(jié)果證明所得蛋白為目標蛋白，具有良好的一致性和 特異性。 ■i 此方案可以處理多達96個樣品效高性，並最大限度地減少需要手動操作的時間逐漸完善。

簡介蛋白質(zhì)純化的目的是為了獲得高純度的穩(wěn)定活性蛋白質(zhì)參與能力，以供下游分析合理需求、研究或治療使用。固定化金屬親和層析法 (IMAC)利用金屬離子萃取具有基因工程標籤的重組蛋白充分發揮，能夠螯合金 屬離子的勝肽鏈高質量。鎳-三乙醇胺四乙酸 (Ni-NTA) 與瓊脂糖樹脂 或磁珠結(jié)合是常用的 IMAC 工具，用於純化多組氨酸 (His) 標 記的蛋白質(zhì)迎來新的篇章。由於His殘基可以整合鎳離子(Ni?+),His 標記的蛋白對固定了 Ni2* 的載體表現(xiàn)出強烈的親和力共創美好。在 Opentrons 蛋白質(zhì)純化工作站上使用 Pierce Ni-NTA 瓊脂糖磁珠萃取帶有 His標籤的GAPDH。

材料與方法IMAC Protocol 實驗流程概述IMAC protocol 的流程分為幾個部分：第一部分：樣品/磁珠混合物的製備薄弱點。目標捕獲部分不在OT-2平臺上進行覆蓋範圍。第二部分：洗滌和洗脫。具體流程如圖1所示積極性。第一部分和第二部分都在OT-2 上執(zhí)行實踐者。針對96個樣品，第一 部分運行時間為57分鐘約定管轄，隨後在搖床上進行30分鐘的目標捕獲數據。第二部分需要78分鐘完成。

OT-2 平臺上的 Ni-NTA 實驗流程第一部分和第二部分的設(shè)備佈局圖如下(見圖2)發揮。協(xié)議的第 一部分和第二部分均在 OT-2 平臺上進行顯著，並使用磁珠純化模 塊將磁珠從溶液中分離出來。樣品處理過程中開放以來，將500 μL 人類 源 His標記的 GAPDH 溶液與12.5 μL 沉澱的磁珠混合占，並在 室溫下以800 rpm 的速度孵育30分鐘。經(jīng)過2 個洗滌步驟 後提供了有力支撐，目標蛋白在250 μL 洗脫緩衝液中以800 rpm 和室溫的條 件在搖床上洗脫10分鐘激發創作。取20 μL 洗脫物進行 SDS-PAGE 和 Western Blot 分析，使用單株抗-GAPDH 抗體 (Thermo Fisher Scientific,USA)和與螢光染料偶聯(lián)的二抗 (LI-COR Biosciences,USA) 進行檢測進一步意見。

結(jié)果GAPDH 在重複實驗中萃取得到 一 致的樣品處理結(jié)果(透過Western blot 分析的蛋白帶訊號測定增幅最大， CV=6%) ( 圖3)。部分萃取物透過使用 QubitTM 蛋 白 質(zhì) 分 析 (ThermoFisher Scientific,USA) 進行定量生產能力，證明了高蛋白質(zhì)產(chǎn)量( 圖 4A) 標準。 此 外 ， 使 用Opentrons 蛋白質(zhì)純化工作站進行 的蛋白質(zhì)純化過程不會破壞蛋白質(zhì)的酶活性堅持好，這是通過GAPDH 活 性 分 析 (Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)檢 測 得 出 的 ( 圖 4B)即將展開。

Ni-NTA 介導(dǎo)的敲低實驗對於在細胞或組織樣本中分離 外源性表現(xiàn)的 His 標記蛋白質(zhì)非常有用。上一個方案用於純 化 2 0 0 μLHEp-2 細胞裂解液中的 His 標 記 GAPDH特性。結(jié)果再次證明 His-GAPDH 成功被萃取傳承，與非標記 蛋白的結(jié)合相比，Ni-NTA 磁珠的親和力特異性非常高 (圖5)。在大規(guī)模蛋白質(zhì)生產(chǎn)中多種，常用大腸桿菌進行重組蛋白表現(xiàn)建設應用。透過裂解有或沒有 IPTG 誘導(dǎo)的 His標記 GAPDH 表現(xiàn)的細菌細胞來製備細胞裂解液。結(jié)果進一步確認了此方案成功地使用 Ni-NTA 磁珠進行了帶有 His 標 記 的 蛋 白 質(zhì) 純 化 ( 圖 6 ) 左右。在這項研究中處理了96個樣本背景下，顯示的結(jié)果僅為在96 孔樣品板的最後 一列中的8個樣品。同時可靠保障，實驗結(jié)果也對不同樣本規(guī)模的運行時間進行了評估(圖7)自然條件。

結(jié)論本次研究在 Opentrons 蛋白質(zhì)純化工作站上運行了一種基於磁珠的 His 標記重組 GAPDH 蛋白質(zhì)純化的自動化實驗流程解 決方案。實驗證明開展， Opentrons 蛋白質(zhì)純化工作站可以在中到高通量的設(shè)定中穩(wěn)定且有效率地處理樣本互動互補，減少操作時間，同時提供符合預(yù)期的可重複性的產(chǎn)出意向。

原文網(wǎng)址：使用Opentrons 蛋白質(zhì)純化工作站進行基於Ni-NTA磁珠的蛋白質(zhì)純化