作者Boren Lin,PhD,Kinnari Watson,PhD

應(yīng)用概述酵素免疫分析 (EIA) 或酵素連結(jié)免疫吸附測(cè)定 (ELISA) 是液體樣本中檢測(cè)目標(biāo)分子(例如抗原)的常用分析工具進一步，通常用於免疫診斷 或研究自動化。本測(cè)定一般採用96 孔板格式具有重要意義，且工作流程通常包括 試劑轉(zhuǎn)移和混合，以及一些在恆定溫度下的孵育和洗滌步驟。這 些步驟均要求樣本處理高度一致性。為了實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，我們使用OT-2 自動(dòng)化移液工作站搭配熱振盪儀研發(fā)並測(cè)試了ELISA 全自動(dòng)化的方案又進了一步，該方案使用Takara Bio 公司的夾心法EIA 試劑盒檢測(cè)人類纖連蛋白(FN),Tecan 的競(jìng)爭(zhēng)法ELISA 試劑盒檢測(cè)唾液中的皮質(zhì)醇，以及Cell Sciences 的另一種競(jìng)爭(zhēng)法ELISA 試劑盒用於定量血清樣本中的中和SARS-CoV-2抗體多元化服務體系。

關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)配備8通道移液管和熱振盪儀的 OT-2 移液工作站具備高精度自動(dòng)化完成 ELISA的能力貢獻力量。在更高的吞吐量設(shè)定中使用，該協(xié)定可以用最少的操作時(shí)間處理多達(dá)96個(gè)樣本。

應(yīng)用介紹酵素免疫分析 (EIAs) 或酵素連結(jié)免疫吸附測(cè)定 (ELISAs) 是一種透過 高度特異的抗體-抗原的相互作用對(duì)液體樣本的目標(biāo)分子(例如 抗原)進(jìn)行檢測(cè)和定量的技術(shù)發行速度。這種測(cè)定通常在96孔或384孔 板上進(jìn)行，我們把抗原固定在孔板上與時俱進，可以透過直接將抗原連接 到固體表面或使用預(yù)塗在固體表面的捕獲抗體來實(shí)現(xiàn)性能。透過這個(gè)過程，它能夠?qū)⒖乖c樣本中其他非標(biāo)靶分子分開綜合運用。

夾心法 ELISA是此測(cè)定方法中最常用的形式供給。常規(guī)步驟如下：1、如果供應(yīng)商未提供預(yù)塗該抗體的孔板體系，我們則需要將捕獲抗體(即與目標(biāo)物特異結(jié)合的抗體)通過被動(dòng)吸附的方式固定在孔板上(例如保障性，8孔或12孔條紋組裝在與96孔微孔板讀取器相容的框架上)。 2.將待分析的樣本加入塗有抗體的板上責任製，使目標(biāo)抗原被捕獲十分落實。 3.將固定的目標(biāo)抗原暴露給與酵素(例如辣根過氧化物酶或HRP)偶聯(lián)的檢測(cè)抗體。 4.加入酵素的底物規則製定，以產(chǎn)生可以測(cè)量和定量的訊號(hào)製造業。

人類纖維連接蛋白(FN)EIA試劑盒 (Takara Bio,美國加利福尼 亞州聖荷西)是一種體外定量測(cè)定血清、尿液關規定、細(xì)胞培養(yǎng)上清液 和其他生物液中可溶性人源 FN 的試劑盒發展基礎。該試劑盒提供了足夠的試劑和材料，可用於在 OT-2 平臺(tái)上進(jìn)行 EIA協(xié)議的設(shè)計(jì)和驗(yàn)證建強保護。

FN 廣泛分佈在細(xì)胞表面同期、細(xì)胞外基質(zhì)和血漿中，參與細(xì)胞基質(zhì)黏 附使命責任、細(xì)胞遷移效果、細(xì)胞形態(tài)的調(diào)控等細(xì)胞功能。 Takara 公司 的 FN EIA試劑盒採用兩種抗人源 FN 的鼠單株抗體強化意識，形成抗體- 抗原-抗體夾心複合物：捕獲抗體預(yù)塗在含8連管長期間，檢測(cè)抗體與過 氧化物酶結(jié)合。透過將此複合物暴露於過氧化物酶的底物中現場，可 以產(chǎn)生光度訊號(hào)高端化，其吸光度與樣本中目標(biāo)物(即人源 FN) 的數(shù)量成正比。

競(jìng)爭(zhēng)法 ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay) 通 過 檢測(cè)訊號(hào)幹?jǐn)_來測(cè)量抗原的濃度我有所應。簡(jiǎn)而言之提單產，目標(biāo)抗原與預(yù)先塗在 孔板上的參照物(抗原)競(jìng)爭(zhēng)與酵素偶聯(lián)抗體結(jié)合。樣本中目標(biāo)抗 原的濃度越高至關重要，參考抗原與抗體結(jié)合的能力就越弱發展空間，產(chǎn)生的訊號(hào) 就越弱首要任務。 一些競(jìng)爭(zhēng)法 ELISA 試劑盒供給，如次本研究中測(cè)試的 Tecan 公司的 Cortisol Saliva ELISA, 酶不是由抗體攜帶，而是由參照 物攜帶，參照物與目標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與抗原-抗體作用效高性。我們?cè)贠T-2 上進(jìn)行測(cè)試另一個(gè)的ELISA 試劑是Cell Sciences 公司(美國馬薩諸塞州紐伯里港)的SARS-CoV-2 替代病毒中和檢測(cè)試劑盒， 用於測(cè)量SARS-CoV-2 感染後或?qū)σ呙缃臃N產(chǎn)生的循環(huán)中和抗體真正做到。中和抗體透過阻斷盤狀病毒融合蛋白的受體結(jié)合域(recep-tor-binding domain,RBD) 與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (angioten-sin converting enzyme 2,ACE2) 結(jié)合有所提升，抑制SARS-CoV- 2 進(jìn)入細(xì)胞。該試劑盒提供預(yù)先塗抹的病毒棘蛋白R(shí)BD板貢獻，以競(jìng)爭(zhēng)法ELISA 的形式規模最大，引入HRP- 偶聯(lián)的ACE2 與中和抗體競(jìng)爭(zhēng)捕獲RBD。

雖然 ELISA 的設(shè)計(jì)方法有很多統籌，但萬變不離其宗最深厚的底氣，他們都遵循相似的工作流程。 ELISA 的常規(guī)操作步驟包括試劑移液振奮起來、孵育以及反覆洗滌品質，這些步驟可以在 OT-2 上輕鬆完成。在每個(gè)試劑步驟之間會(huì)進(jìn)行連續(xù)的洗滌等地，以去除未結(jié)合的分子最為顯著。為了防止剩餘的溶液帶到下一個(gè)試劑步驟中，把過量的液體全部吸走非常重要規定。 Opentrons的8通道移液管可進(jìn)行高效環境、精準(zhǔn)的移液處理，以滿足 ELISA 中試劑移液和洗滌的需求高質量。此外相對簡便，可以透過添加 Opentrons 溫控模組或熱振盪儀，以提升自動(dòng)化功能和滿足實(shí)驗(yàn)中的樣品孵育環(huán)節(jié)(例如設(shè)定為37℃以促進(jìn)抗原-抗體相互作用)所需的恆溫功能流程。

材料與方法圖1-3顯示了在 Opentrons OT-2 上測(cè)試的三種 ELISA 的示意圖合作，包括試驗(yàn)步驟概述和甲板佈局。

液體轉(zhuǎn)移是透過8通道移液器進(jìn)行的助力各業。 ELISA 孔板使用了一個(gè)帶有 有裂縫密封的封膜 (BioChromato, 日本藤澤),這樣移液器 的吸頭可以穿過封膜極致用戶體驗，同時(shí)在孵育期間防止蒸發(fā)。然後應用，ELISA 板被固定在熱振盪儀上建議，並按照說明書的要求提供熱力和攪拌 作用(參考表1)。在完成實(shí)驗(yàn)後相貫通，需要立即手動(dòng)將 ELISA 孔板移至酶標(biāo)儀不斷發展，並在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值。

為了測(cè)試 FN EIA 試劑盒，首先將人類血漿中的 FN 溶解在去離子水中緊密協作，製備出1 mg/mL 的儲(chǔ)備溶液越來越重要，然後進(jìn)一步稀釋至500 ng/mL 並進(jìn)行2倍的連續(xù)稀釋。而對(duì)於皮質(zhì)醇 ELISA 測(cè)試規模，則 使用試劑盒提供的已知皮質(zhì)醇濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和控制液近年來。先前已 經(jīng)測(cè)試 SARS-CoV-2 抗體陽性或陰性的血清樣本將用於病 毒中和 ELISA 實(shí)驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)在不同樣本量下的運(yùn)行時(shí)間是可預(yù)估的(參考表1)發展目標奮鬥。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果將 FN EIAs 在 OT-2 上處理性能穩定。可以透過評(píng)估最終讀數(shù)與目標(biāo)分子濃度之間的相關(guān)性以及不同實(shí)驗(yàn)之間這種相關(guān)性的一致性來評(píng)估樣本處理品質(zhì)作用。透過繪製平均吸光度 (n=3)與 FN 濃度之間的關(guān)係圖，並計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差行業分類，可以確定線性迴歸的擬合優(yōu)度技術特點。

結(jié)果展現(xiàn)了 OT-2 在執(zhí)行該試劑盒的實(shí)驗(yàn)中的準(zhǔn)確性和精密度(R平方>0.99,CV<10%) (圖4A), 和重複性(圖4B)。使用皮質(zhì)醇的連續(xù)稀釋來測(cè)試OT-2上的競(jìng)爭(zhēng)法 ELISA 發展邏輯。結(jié)果顯示液體處理的一致性(n=3,CV<10%),在半對(duì)數(shù)圖上呈現(xiàn)了試驗(yàn)讀數(shù)與對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換後的樣品濃度之間的優(yōu)秀負(fù)線性關(guān)聯(lián)(R 平方>0 .99 ) ( 圖5A), 且實(shí)驗(yàn)之間具有可重複性(圖5C)凝聚力量。

為了檢測(cè)競(jìng)爭(zhēng)法 ELISA 中 ACE2-RBD 結(jié)合的抑製作用，血清樣本 在 OT-2 上進(jìn)行了三次處理聽得進，在酶標(biāo)儀上測(cè)量吸光度新的力量，並獲得了變異係數(shù)。結(jié)果再次確認(rèn)了 OT-2 液體處理的精確性 (CV<10%)(圖6)便利性。根據(jù)廠商的說明書全面展示，實(shí)驗(yàn)是有效的，因?yàn)槊總€(gè)控制組 的 OD450 值都在標(biāo)準(zhǔn)範(fàn)圍內(nèi)(陽性對(duì)照<0.3,陰性對(duì)照>0.9)深刻認識。抑制率的計(jì)算公式如下：

本實(shí)驗(yàn)成功檢測(cè)到先前被診斷為SARS-CoV-2抗體陽性的樣本中能夠中和 ACE2-RBD 交互作用的抗體(表格1)主動性。

實(shí)驗(yàn)總結(jié)透過使用OT-2 進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性ELISA和中和抗體檢測(cè)規模設備，我們得出結(jié)論：1、在OT-2 上進(jìn)行的稀釋處理和吸光度測(cè)量顯示了高度一致的結(jié)果指導，證實(shí)了OT-2 液體處理的精確性和可重複性競爭力。 2.根據(jù)廠商說明書的要求，實(shí)驗(yàn)的控制組的 OD450 值都在有效範(fàn)圍內(nèi)規則製定，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)的有效性製造業。 3.利用實(shí)驗(yàn)測(cè)量的抑制率，成功檢測(cè)到先前被診斷為SARS-CoV-2 抗體陽性的樣本中存在的中和抗體。 4.表格2的人體血清樣本確認(rèn)為陽性組合運用，進(jìn)一步證實(shí)了其先前 ELISA檢測(cè)的結(jié)果更讓我明白了。綜上所述，該實(shí)驗(yàn)在檢測(cè)中和抗體方面表現(xiàn)出優(yōu)越的精確性和可靠性 積極，OT-2 的樣品處理能力足以與傳統(tǒng)手動(dòng)方法相媲美探索。