摘要三個圖書館準備工具包-Illumina?DNA準備工具包影響，KAPA?超級準備工具包和NEBNext?Ultra?II試劑盒-都是透過Opentrons OT-2自動快速和穩(wěn)健地製備下一代定序的高品質(zhì)文庫建設應用。從lambda和人類基因組DNA中製備了100 ng輸入的文庫。觀察到庫的類似性能面向，用OT-2上的三個套件準備的樣本變異性和產(chǎn)量。類似的排序指標明顯，如條碼平衡和序列比對也觀察到覆蓋範圍特點。

介紹DNA文庫的製備是下一步工作的關(guān)鍵步驟代定序（NGS）。自動化的DNA文庫製備為建構(gòu)高產(chǎn)量定序文庫提供了一種簡化的方法同時盡量減少實際操作時間著力提升。在這裡深刻內涵，我們描述海百合DNA製備自動化的效率裝備(伊利，CatNo融合。20018705)深入闡釋，KAPA超級試劑盒(羅氏?. , CatNo.7962363001)和NEBNext超II試劑盒(新英格蘭生物實驗室?. , CatNo .E7645L)在OT-2機器人液體處理平臺上。

材料與方法Illumina DNA製備試劑盒完成的事情、KAPA超級製備試劑盒物聯與互聯、NEBNext Ultra II和視中心OT-2平臺概述擁有專利NGS標記工作流程，利用珠聯(lián)轉(zhuǎn)座體改造層面，這不同於KAPA HyperPrep和NEBNext Ultra II工作流程-DNA末端修復(fù)和a尾的解決流程紮實。

對於Illumina DNA準備試劑盒，使用OT-2上的雙索引適配器對DNA進行標記和標記新體系。 DNA樣本（n=8,100 ng）量化投入力度，歸一化到一個4 nM的庫，匯集到一個多路復(fù)用的樣本尤為突出，然後在一個2x75上運行在Illumina MiSeq上的流式細胞進行基因組測序規定。工作流程包括產(chǎn)生DNA準備庫Lambda（n=24）和人類基因組DNA樣本（n=8）。

對於HyperPrep和NEBNext Ultra II DNA製備試劑盒空間載體，我們在OT-2上建構(gòu)了抗體DNA片段（n=8,100 ng）的DNA文庫高質量。使用的條碼來自KAPA獨特的雙索引適配器，和NEB多重雙索引II為NEBNext索引設(shè)定1重要組成部分。樣本被定量流程、歸一化，並彙集到一個4 nM的文庫中勃勃生機，並在一個帶有2x75的MiSeq上進行測序流路池該工作流程包括為=片段DNA（n=24）和人類基因組DNA（ n=8）產(chǎn)生文庫助力各業。

定序資料由Illumina公司進行解復(fù)用基本空間?根據(jù)適配器的條碼序列，並與參考基因組對齊提供有力支撐。利用Geneious技術(shù)對此基因組的覆蓋圖譜進行了分析?主要的2021.2.21. 我們的數(shù)據(jù)顯示了較低的樣本變異性和在OT-2上使用DNA製備試劑盒製備的文庫的可靠一致性應用。

OT-2工作流程協(xié)定的原理圖

對於Illumina的DNA準備試劑盒，DNA和IDT?為了伊利DNA/RNA UD指數(shù)集A品率。 .在OT-2上進行了標記（圖1）相貫通。 A清洗步驟是必要的不斷發展，以去除殘留的DNA和適配器接下來，使用具有可編程蓋子和塊溫度的OT-2甲板上熱循環(huán)器進行PCR擴增自動化方案。

對於HyperPrep和NEBNext Ultra II DNA製備試劑盒緊密協作，都以NEB片段酵素進行片段化。人類16分鐘線上線下，人類20分鐘基因組DNA穩定性，然後用AMPure進行清理?XP珠子(貝克曼庫爾特，CatNo過程中。.A63881).對OT-2進行DNA末端修復(fù)/A尾跡，然後是AMPure XP珠子清理步驟能運用、條碼或適配器連接（圖1）達到。使用的條碼來自KAPA獨特的雙索引適配器(羅氏，CatNo不可缺少。08861919702). 對於HyperPrep和NEB多重雙索引引子集1 (NEB蓬勃發展，CatNo。E7335L)為NEBNext Ultra II積極回應。 .

使用甲板上的熱循環(huán)器在OT-2上進行DNA擴增重要性。

工作流程佈局Opentrons OT-2平臺的佈置包括模組、實驗室軟體和DNA準備試劑（圖2）有所提升。雖然工作流程包括在OT-2上的自動移液聽得進，但需要手動幹預(yù)，在甲板上的恆溫器和磁塊之間移動樣品板先進水平，並在此期間重置移液管尖端架協(xié)議便利性。

圖2：OT-2甲板佈局

模組，實驗室軟體重要平臺，和DNA準備試劑深刻認識。這個

標準化的甲板佈局與HyperPrep和其他平臺共享

NEB下一個Ultra II。此工作流程在OT-2上自動移液應用提升，需要手動幹預(yù)在甲板上恆溫筆和之間移動樣品板(1)

磁性磁塊(2)主動性，以及在運作過程中重置尖端機架。甲板佈局包括1個NEST 12井儲層發展的關鍵，1 x 96井鋁塊道路，1個熱循環(huán)器上的200μl PCR板，溫度模組上的1個NEST0.1 mL PCR板(3)真諦所在。模組包括一個磁性模組責任製、溫度模組、熱循環(huán)器模組倍增效應，以及P20和P300 8通道移液管規則製定。

結(jié)果DNA文庫擴增使用PicoGreen檢測DNA文庫?在一個量子位元?4.用螢光計測定濃度製造業。 CV（變異係數(shù)為標準差除以平均值）。所有文庫的最終洗脫體積均為30μL關規定。對於使用Illumina準備的庫DNAPrep（n=8,100ng）的CV為10.7%（n=24,100 ng）的CV為16.6%（表1A）發展基礎。為文庫使用HyperPrep製備，CV為（n=8100ng）的13.4%建強保護，（n=24100ng）的CV為17.6

. 1B)使用NEBNext Ultra II製備的文庫顯示（=8）的CV為12.1%同期，（=24）的CV為14.5%（表1C)。在OT-2上製備的lambda和人類DNA文庫的產(chǎn)量（ng/μl）使命責任、CV（%）和片段大行Ч?。╞p）的比較見表2。

DNA製備文庫的小基因組定序多路復(fù)用的DNA準備文庫(n=8,100在Illumina上使用2x75流動細胞進行定序MiSeq儀器合規意識。第二批DNA準備文庫（n=24,100 ng）在OT-2上的3個單獨的欄位中進行處理密度增加，以解釋一批內(nèi)的任何柱間變異性。

以DNA製備文庫的片段大小來確定在OT-2上製備的文庫的可靠均勻性（表3A-3C）創新內容。同樣機遇與挑戰，在OT-2上建構(gòu)的48 kb基因組的一致定序覆蓋顯示了8倍路DNA製備文庫的一致性（表4）。

條碼平衡是準確的DNA準備樣本顯示的平均11.2%–12.31%的伊利米納DNA Prep服務延伸，KAPA HyperPrep的10.6%–14.1%共創輝煌，NEBNextUltraII的10.5%–14.6%（圖3）.比較DNA製備試劑盒的尖端分配和OT-2方案的持續(xù)時間（表5）。

結(jié)論我們驗證了免疫DNA準備進一步，KAPA超準備大部分，和NEBNext Ultra II在OT-2和展示了它在下一代定序的文庫製備中的應(yīng)用。我們發(fā)現(xiàn)實際需求，DNA Prep樣本在複製和化學中表現(xiàn)出低可變性解決，甚至樣本條碼平衡，並且高序列比對的覆蓋範圍敢於監督，表明OT-2可以用來可靠地自動化製備高品質(zhì)的DNA文庫幅度。

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